兩種造模方法建立大鼠冠脈微循環障礙模型比較研究

李 磊,孟紅旭,付建華,金 龍,馬彥雷,史 躍,劉建勛

(中國中醫科學院西苑醫院基礎醫學研究所,國家中醫心血管病研究中心,中藥藥理北京市重點實驗室,北京 100091)

冠心病是嚴重威脅現代人類生命和健康、危害極大的疾病,隨著我國社會經濟迅速發展,人口老齡化及城鎮化進程加速,我國冠心病發病人數持續增加。 長期以來,冠狀動脈主干狹窄所致的心肌供血不足被認為是冠心病的主要病因,經皮冠脈造影檢查被認為是診斷冠心病的“金標準”,然而約20%~30%因胸痛接受冠脈造影檢查的患者并無明顯的冠狀動脈主干和主要分支狹窄或閉塞,這種胸痛被認為與冠狀動脈微血管功能異常有關,故稱為微血管性心絞痛或心臟X 綜合征[1]。 雖然經皮冠狀動脈介入治療(PCI)可以重建心外膜冠狀動脈血流供應,明顯改善急性心肌梗死降低冠心病死亡率,但是PCI 術后常伴隨出現冠脈緩慢血流(slow flow)或無復流(no reflow),臨床觀察這部分患者并未從PCI 治療中受益,梗死區域冠狀動脈微血管病變被認為是心肌無法恢復正常血液灌注的主要限制因素[2]。 在對微血管性心絞痛、PCI 術后無復流現象以及肥厚性心肌病等疾病研究的深入,研究者發現這類疾病的共同發病機制與冠狀動脈微循環功能障礙(coronary microvascular dysfunction,CMD)密切相關[3]。 冠狀動脈微循環障礙通常是指發生于直徑小于300 μm 心臟血管的結構和功能改變[4]。 目前,CMD 發病機制仍然沒有完全被闡明,一般認為血管內皮損傷、血管平滑肌功能異常,機械性壓迫、冠脈微栓塞以及缺血再灌注損傷等與CMD 的發生密切相關。 不論何種原因導致的CMD,最終也會和心外膜冠脈狹窄一樣導致心肌耗氧的供需失衡,引起臨床癥狀并影響心血管疾病的診療和預后[5]。

冠狀動脈微循環障礙模型動物是研究冠狀動脈微循環障礙類疾病發展轉歸及評價藥物治療作用必不可少的工具。 根據冠脈微循環障礙的類型不同和實驗操作的可能,冠脈微循環障礙動物模型的建立常見的方法有在冠脈內或心室內注射微栓塞劑、缺血再灌注損傷、糖尿病或高血壓等心肌病伴隨微循環障礙等[6-7]。 栓塞劑注射法具有治病因素單一、可控的優勢,常常用于建立急性期的冠脈微循環障礙動物模型,根據栓塞劑的不同可分為微球機械性栓塞法、自體微血栓法和化學損傷內皮法[8]。 化學損傷法一般在大鼠上應用,通過心室內或主動脈根部注射月桂酸鈉,由于月桂酸鈉具有強烈的內皮損傷作用,能夠誘發血小板黏附、聚集、形成微血栓,而較大動脈內無明顯血栓形成[9]。 微球栓塞法多在小型豬、犬等大動物上應用,多在介入造影輔助下,采用超選擇性冠脈內注射微球[10-11]。自體血栓栓塞法由于制備過程較復雜,發病機理較復雜,使用并不是很廣泛。 目前,應用大鼠建立冠脈微循環障礙模型的報道較少,月桂酸鈉損傷法與微球栓塞法建立模型比較研究尚未見報道。 因此,本研究旨在比較月桂酸鈉損傷內皮法與微球栓塞法冠脈微循環障礙模型的差異,確定病變程度適合的造模條件,為疾病發生過程及治療藥物作用機理研究提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級雄性SD 大鼠30 只,體重(340±20)g,由斯貝福(北京)生物技術有限公司[SCXK(京)2019-0010]提供。 動物實驗操作及飼養均在中國中醫科學院西苑醫院實驗動物中心進行[SYXK(京)2018-0018]。 實驗動物及實驗步驟符合國家實驗動物管理條例。 該研究經中國中醫科學院西苑醫院動管理委員會批準實驗(2020XLC007-2),實驗動物處置均符合國家科委2011 年修訂的《實驗動物管理條例》,并遵循:“減少、替他和優化”3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

月桂酸鈉購于美國SIGMA 公司;40~120 μm栓塞微球購于美國Merit Medical 公司;肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB 同工酶(CK-MB)以及乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒購于和光純耀(上海)化學有限公司;硫酸阿托品注射液購買于上海禾豐制藥有限公司;肝素鈉注射液購于常州千紅生化制藥股份有限公司;本實驗其他藥物及器材均為實驗室常規器材。

DW-3000S 型雙通道小動物呼吸機,安徽正華生物儀器設備有限公司;Visual Sonics Vevo2100 系高分辨率小動物超聲影像系統、MS-201 高頻線陣探頭(Fujifilm,日本)公司;MP-150 型多導生理記錄儀、TSD104 型血壓換能器、 DA100C 放大器及AcqKonwleage 4.1 數據采集軟件(BioPac,美國);LABOSPECT003 型全自動生化分析儀(Hitachi,日本)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備

30 只SD 雄性大鼠,隨機分為假手術組、月桂酸鈉組和微球栓塞組,每組10 只動物。 大鼠常規麻醉后胸前區備皮。 為防止分泌物對呼吸管影響,于術前10 min 腹腔硫酸注射阿托品注射液。 大鼠取仰臥位固定于手術板上,把頭頸部拉直固定,先將手術板底部固定,將大鼠頭部側上臺至45°傾角并固定,用小兒麻醉咽喉鏡(壓舌板前段切去一半寬度)觀察大鼠聲門,用心血管介入用導引鋼絲趁大鼠吸氣聲門打開時插入氣管,在導引鋼絲的導引下將氣管插管送入起到氣道,退出導引鋼絲。 將一面小鏡子放于氣管插管口,若見鏡面上隨大鼠呼吸運動有水霧出現,則為插管在氣道內,將氣管插管與小動物呼吸機連結。

于左前外側沿胸骨左側緣縱向切開皮膚,鈍性分離肌層,打開大鼠胸腔,暴露第4 肋中部并縱向剪斷,以垂直肋骨方向放置大鼠開胸器,輕輕剪開心包膜的心臟部位充分暴露[9]。 仔細分離主動脈弓,并在其下穿一棉線,令大鼠穩定10 min 后,將棉線兩端提起并用血管夾夾閉主動脈,迅速以注射器從心尖部直接向左心室注射0.2 mL 的栓塞微球(微球直徑40~120 μm,約含1000 個微球)或月桂酸鈉(1 g/L,生理鹽水溶解),注射前要回抽血以確保針尖在心腔中,夾閉20 s 后,松開血管夾,待呼吸心跳穩定后,徹底止血、逐層縫合肌肉和皮膚,最后關閉胸腔,見圖1。 拔除氣管插管,術畢腹腔注射80 萬單位青霉素,普通飼養。 假手術組手術過程采用同樣的操作,區別僅在于心室內注射0.2 mL 生理鹽水。 術后24 h 再次麻醉動物測定相關指標處死取材。

圖1 大鼠冠脈微循環障功能礙模型建立Figure 1 Establishment of rat model of coronary microcirculation dysfunction

1.3.2 超聲心動圖檢測心功能

動物術后24 h,按1 mL/100 g 劑量腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,大鼠麻醉后取仰臥位固定。 當大鼠心律趨于持續性、穩定性時開始檢測,在進行超聲心動圖檢查時要注意觀察大鼠的呼吸狀態,如出現明顯呼吸抑制應終止檢查,進行呼吸支持。 以高頻探頭進行定位,在左室長軸及胸骨旁短軸各切面應用M 模式超聲心動圖觀察心臟運動,選用左室長軸切面計算左室舒張末期內徑(LVIDd)、左室收縮末期內徑(LVIDs)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分數(EF)、左室縮短率(FS),各項指標均選取連續測量5 個心動周期測量值的平均值[12]。

1.3.3 血流動力學檢測

將麻醉穩定的大鼠仰臥位固定,頸部備皮,分離右頸總動脈,結扎遠心端,動脈夾夾住近心端,經右頸動脈穿刺插入20 G 靜脈留置針,撤去動脈夾,將肝素化留置針送入大鼠頸總動脈。 留置針連接壓力換能器,經MP-150 型多導生理記錄儀連接電腦,通過AcqKnowledge 軟件實時顯示壓力變化曲線。 待大鼠狀態穩定后,測定動脈收縮壓(SBP)和舒張壓(SDP),計算平均動脈(MAP)。 測定完動脈血壓后,輕柔將留置針插入右心室腔,當留置針突然隨心臟搏動抖動明顯時,應減緩推送速度。 當軟件顯示由血壓波變為下達0 mmHg 附近時,表明留置針已經通過主動脈瓣進入左心室腔內[13]。 記錄心臟血流動力學指標:左室峰壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左室內壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)。 體表標準II 導心電圖計算心率(HR)。

1.3.4 血清CK、CK-MB 和LDH 活性檢測

大鼠測定完血流動力學指標及超聲心動圖之后,腹主動脈取血4 mL,室溫靜置1 h 后,2500 r/min,離心10 min,取上清,采用生化分析法檢測肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶LDH 活性。

1.3.5 病理HE 染色

取大鼠心臟組織于4 %多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋,連續切片(5 μm),蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察心肌組織改變。

1.4 統計學方法

實驗數據采用平均數±標準差() 表示,應用SPSS 18.0 軟件進行統計分析,采用One-way ANOVA(單因素方差分析)方法,方差齊性應用Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗,方差不齊采用Tamhane’s T2 檢驗。P<0.05 為有統計學意義。

2 結果

2.1 對大鼠超聲心動圖的影響

與假手術組比較,微球栓塞組左室收縮末期內徑(LVIDs)明顯增加、LVIDs,左室收縮末期容積(LVESV)明顯增加,每搏輸出量(SV)顯著減少(P<0.05),見表1;左室射血分數(EF)、左室縮短率FS顯著降低約(P<0.01)。 提示經左心室注射40~120 μm 栓塞微球,造模24 h 后可以明顯降低動物心功能。 與假手術組比較月桂酸鈉組各項超聲心動圖指標未見明顯統計學差異(圖2、表1)。

表1 大鼠超聲心動圖指標的變化Table 1 Changes of echocardiography parameters in rats

圖2 對大鼠超聲心動圖變化Note. A, Sham group. B, Laurate group. C, Microsphere group.Figure 2 Changes of echocardiography in rats

2.2 對大鼠心臟血流動力學的影響

月桂酸鈉組和微球栓塞組大鼠動脈收縮壓、舒張壓及平均動脈壓略低于假手術組,各組間未見統計學差異;大鼠心率在各組間未見明顯差異(數據略)。 月桂酸鈉組和微球栓塞組大鼠左室峰壓略低于假手術組,各組間未見統計學差異;各組間左室舒張末壓未明顯差異;微球栓塞組左室內壓最大上升速率明顯低于假手術組,兩組間比較有統計學差異,P<0.05,月桂酸鈉組與假手術組未見明顯差異。各組間左室內壓最大下降速率未見統計學差異(圖3、圖4)。

圖3 大鼠左室內壓變化速率Note. Anterior portion indicate the change rate of arterial blood pressure, posterior portion indicate the change rate of left ventricular internal pressure. A, Sham group. B, Laurate group.C, Microsphere group.Figure 3 Changes rate of left ventricular pressure in rats

圖4 大鼠心室內壓改變Note. A, Sham group. B, Laurate group. C, Microsphere group. Compared with the sham group,?P<0.05.Figure 4 Changes of left ventricular pressure in rats

2.3 對大鼠血清CK、CK-MB 和LDH 的影響

與假手術比較,兩種造模方法均可以升高大鼠血清CK、CK-MB、LDH 活性,然而月桂酸鈉組與假手術組比較未見統計學差異。 微球栓塞組可以顯著升高CK-MB 與LDH 活性與假手術比較有統計學差異(P<0.05),見表2。

表2 大鼠心肌酶的變化Table 2 Changes of myocardial enzymes in rats

2.4 對大鼠心肌HE 染色影響

HE 染色見假手術組大鼠心肌纖維排列整齊,心肌細胞胞漿豐富,細胞核形態規則。 月桂酸鈉組大鼠心肌細胞均呈現不同程度的溶解、斷裂;心肌間不同程度的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和中性粒細胞浸潤,心肌內微血栓形成。 微球栓塞組心臟病變同月桂酸鈉組相似,均出現不同程度的心肌溶解、斷裂;心肌間淋巴細胞浸潤和纖維組織增生,心臟外膜可見不同程度的充血,炎細胞浸潤,并可見微球栓塞(圖5)。

圖5 大鼠心臟組織HE 染色變化Note. A, Sham group. B, Laurate group. C, Microsphere group. Black arrow indicates microthrombosis. Red arrow indicates microsphere embolism.Figure 5 Changes of HE staining in rat heart tissue

3 討論

冠狀動脈微栓塞是引起冠脈微循環障礙的重要原因,建立冠脈微栓塞的動物模型是探討冠脈微循環障礙發生、發展病理生理過程、研究藥物作用及機制的重要實驗平臺[14]。 本實驗分別對兩種不同造模方法建立的冠脈微循環障礙模型進行了研究,結果顯示通過心室內注射月桂酸鈉注射后可以損傷血管內皮形成微血栓,栓塞微球則直接以物理栓塞的方式導致微血管栓塞,兩種造模方法均可以造成冠脈微循環障礙,對大鼠心臟功能有一定影響。 栓塞微球較月桂酸鈉造模更加穩定,在模型建立后24 h 可見明顯心功能降低、血流動力學改變及心肌酶升高。

制作冠脈微栓塞動物模型的栓塞劑(致栓劑)主要有月桂酸鈉、栓塞微球、自體血栓等。 自體血栓雖然符合臨床微血栓栓子特點,但制備相對復雜,且凝固后研磨成的顆粒狀栓子的數量和大小不均,不能模擬血管內皮損傷后始動的病變,在實驗研究中的應用并不多。 月桂酸鈉可導致血管內膜損傷、脫落、穿孔,促進血小板粘附、聚集,形成閉塞性血栓造成冠脈微循環阻塞,而較大的動脈內無明顯血栓形成,較自體血栓法更加接近實際病理發展過程[15];該法的主要缺點在于不是臨床上冠脈微循環血栓形成的常見病因。 有文獻報道,100 μg 月桂酸鈉冠脈內注射時幾乎形成不了冠脈微血栓,而200 μg 月桂酸鈉在冠脈注射1 h 后即有微小動脈血栓形成,3 h 后達到高峰,在此后的12~24 h 逐漸降低[16]。 本研究采用的月桂酸鈉劑量為200 μg,注射24 h 后在100 μm 以下的微血管可見微血栓形成,而模型24 h 時血流動力學、心功能及心肌酶等指標與假手術組比較未見明顯差異,這可能與微血管血栓形成減少有關。

經冠脈內注射栓塞微球是建立大動物冠脈微循環障礙的常用方法,栓塞微球形成微栓塞機制與臨床上冠脈血運重建術后微血栓、內皮細胞內皮脫落、動脈粥樣硬化斑塊破裂碎片脫落后,隨血流至冠脈微血管致栓塞原理類似。 由于大鼠心臟較小無法使用臨床心導管介入技術將栓塞微球超選擇注射到冠脈里,通常使用心室內注射栓塞微球,暫短夾閉主動脈的方法建立冠脈微栓塞導致的冠脈微循環障礙模型[17-18]。 臨床尸檢顯示心臟性猝死中微血管栓塞89%發生于小120 μm 的血管,在小于120 μm 的血管栓塞中39%發生于小于40 μm 的微血管,46%發生于40~80 μm 的微血管,15%發生于81~120 μm 的微血管[19]。 因此,冠脈微循環障礙動物模型通常采用42 μm 微球或40~120 μm 混合微球冠脈內注射模擬臨床冠脈微血管栓塞,大鼠實驗中常采用心室內注射1000~3000 個微球進行造模[20-21]。 本研究采用了40~120 μm 混合栓塞微球約1000 個進行了心室內注射造模,造模術后24 h后可見栓塞微球阻塞,與假手術比較可以明顯降低左室內壓最大上升速率、降低實驗動物心功能降低超聲心動圖EF 和FS 值等,升高心肌損傷指標CKMB 和LDH。

與假手術組比較,月桂酸鈉組與微球栓塞組動物心臟組織病理HE 染色,并未見大量的壞死心肌細胞、炎細胞浸潤等嚴重的心肌組織受損,這可能與造模為微血管損傷并未損傷大血管的血供,組織可以從鄰近的微血管獲取血供,以及造模時間較短(24 h)有關,之后研究將進一步探索適合冠脈微循環障礙評價的病理染色方法。

綜上所述,本研究所用的心室內注射月桂酸鈉及栓塞微球兩種造模方法均可以造成冠脈微循環障礙,對大鼠心臟功能有一定影響。 兩種造模方式導致冠脈微循環障礙的程度有所不同,微球栓塞法較月桂酸鈉法建立的動物模型關鍵指標更加穩定,可廣泛應用于冠脈微循環障礙的發病機制、藥物治療作用等研究。