神經母細胞瘤腎上腺原位移植瘤動物模型的建立

劉 波,苗佳寧,張斯萌,李志杰?

(1.中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心,沈陽 110004;2.遼寧省環境與代謝疾病動物模型研究與應用重點實驗室,沈陽 110004)

神經母細胞瘤(neuroblastoma,NB)是兒童常見的一種交感神經系統的惡性胚源性腫瘤,其起源于神經嵴,惡性度極高,預后極差,但具有自行消退和體外誘導分化成熟的特點[1-2]。 如何治愈NB 是目前腫瘤界研究的焦點問題,而動物模型是腫瘤疾病臨床前研究的重要組成部分,其中小鼠移植瘤模型可模擬人腫瘤自然生長過程,是目前主流的研究NB的動物模型。 移植瘤模型可分為異位移植和原位移植模型,約60%的NB 原發于腹膜后,來源于腎上腺髓質或交感神經節,因此異位移植瘤模型并不能完全模擬NB 的生物學行為,而原位移植瘤模型在生物學特性上更貼近臨床實際[3-4]。 本文旨在研究腎上腺原位移植NB 動物模型的造模方法及特點,對進一步研究NB 發生、發展及治療奠定了良好的科研基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

實驗動物選用SPF 級SCID-Beige 免疫缺陷小鼠,雌性,5 周齡,體重14~16 g,30 只購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]。 無菌手術在中國醫科大學附屬盛京醫院實驗研究中心動物實驗室屏障動物實驗設施進行[SYXK(遼)2017-0004],本實驗經中國醫科大學附屬盛京醫院醫學科研與新技術倫理委員會批準(2014PS48K),并按動物實驗使用的3R 原則給予人道的關懷。

1.1.2 細胞

應用神經母細胞瘤SK-N-BE2(BE2)細胞系進行造模(BE2 細胞系由美國國立衛生研究院-國家癌癥研究所-分子細胞生物實驗室Dr.Carol.J.Thiele博士惠贈)。 用含10%胎牛血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養液,培養于37℃、5% CO2的孵箱內,2~3 d 傳代一次,取對數生長期的細胞用于實驗[5]。

1.2 主要試劑與儀器

10%胎牛血清、2 mmol/L 谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的RPMI 1640 培養液(以色列BI 公司);體式顯微鏡(寧波永新光學股份有限公司, 型號:NSZ-608T);小動物呼吸麻醉機(美國MATRX, 型號:MODLE3000)。

1.3 實驗方法

1.3.1 注射細胞準備

腫瘤細胞接種實驗當天將BE2 細胞用胰酶消化后,按照PBS ∶基質膠=1 ∶1的比例稀釋BE2 細胞,制成2×106/50 μL 的細胞懸液用于腫瘤細胞接種。

1.3.2 NB 細胞接種

30 只SCID-Beige 小鼠隨機分為兩組,A 組為皮下異位移植組,B 組為腎上腺原位移植組,皮下異位移植瘤組9 只,原位移植瘤組21 只,標記編號并稱量體重。 A 組動物在無菌條件下,將準備好的細胞懸液抽取50 μL 經皮下注射到小鼠右側腋下位置,注射完畢后放回飼養籠內正常飼養。 B 組動物氣體誘導麻醉后,小鼠右側下肋部及上腹部備皮消毒,開腹后暴露右側腎上腺及周圍脂肪層,將準備好的細胞懸液抽取50 μL,體式顯微鏡下注射到腎上腺周圍脂肪層內,關腹,免拆縫合線縫合并消毒創口,待小鼠蘇醒后放回飼養籠內正常飼養[6-8]。

1.3.3 術后觀察

BE2 腫瘤細胞接種后第2 天開始每天記錄小鼠體重變化。 接種腫瘤細胞后第14、21、28 天比較A、B 兩組成瘤情況及腫瘤大小。 腫瘤大小測量:記錄腫瘤最長徑a 和最短徑b,采用公式V=a×b2/2 計算腫瘤體積,皮下異位移植瘤腫瘤大小每周測量3 次,腎上腺原位移植瘤腫瘤大小測量取材后腫瘤組織大小。 組織形態學檢查:A 組取完整腫瘤標本、B 組將腫瘤、左腎及腎周脂肪一并取出,于4%多聚甲醛內固定,行HE 染色,觀察鏡下病理改變[9]。

1.4 統計學方法

應用軟件GraphPad Prism 8 進行統計分析。 計量資料以平均數±標準差(±s)表示,兩組間均數比較使用t檢驗;成瘤率采用Fisher 檢驗,P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經母細胞瘤腎上腺原位移植模型建立

無菌條件下使用異氟烷,通過小動物呼吸麻醉機誘導麻醉并將流量控制在氧氣流量200 mL/min,異氟烷濃度3%持續麻醉,常規備皮消毒后的左側上腹部隱約可見小鼠脾位置,在脾尾端及肋緣下部交界處橫向行0.5~1 cm 切口并逐層切開至腹腔,鏡下用無損顯微鑷輕柔的將脾撥向頭側并在皮層擠壓下固定脾,暴露手術所需視野,此時可見脾覆蓋下的左側腎上級部分,用無菌棉簽將腎輕柔向小鼠尾側撥動,此時將暴露腎上腺及周圍脂肪層,將準備好的NB 細胞懸液50 μL 抽入針尖型號為28 G的注射器內,鏡下左手用棉簽固定腎上腺脂肪位置,右手持注射器,在腎上腺周圍脂肪處盡量平行進針,注意針尖不可觸碰到腎上腺,針尖不可穿透脂肪層,確定針尖斜面全部進入脂肪層后緩慢注射細胞懸液,注射后可見脂肪層快速形成丘狀隆起,確認細胞懸液全部注射入脂肪層后快速拔出注射器的同時左手棉簽抵住入針位置1~2 min 避免漏液。 而后恢復脾位置,逐層縫合肌肉層及皮層,縫合處消毒并停止異氟烷麻醉,待小鼠蘇醒后放回飼養籠內正常飼養[10-13]。 (圖1)

圖1 神經母細胞瘤腎上腺原位移植動物模型的制作Note. A, Fix the mouse supine and prepare the skin for the operation. B, Make the incision on the skin. C, Expose the left adrenal gland and the surrounding fat pad. D, Stab into the fat pad. E,Inject the neuroblastoma cells. F,Appearance after injection finished.Figure 1 Establishment of the orthotopic neuroblastom xenograft model

2.2 腎上腺原位移植瘤與皮下異位移植瘤組間成瘤情況比較

在接種相同數量腫瘤細胞的情況下,分別在14、21、28 d 比較兩組小鼠的成瘤率(表1)、平均腫瘤體積(表2)及腫瘤生長情況(圖2)。 如表1 所示,接種相同數量腫瘤細胞后,原位移植瘤與皮下異位移植瘤成瘤率相比具有統計學差異(P=0.0114)。 結果提示,原位移植瘤的成瘤率高,且成瘤明顯早于皮下異位移植瘤。 28 d 內動態觀察并記錄腫瘤大小。 皮下異位移植瘤組共9 只小鼠,分別在14、21、28 d 時測量腫瘤大小;腎上腺原位移植瘤組共21 只小鼠,分別在14、21、28 d 各處死7 只,取出腫瘤組織測量腫瘤大小。 如表2 所示,與皮下移植瘤相比,原位移植瘤生長速度更快,腫瘤體積更大,差異具有統計學意義(14 d 時P<0.05,21 d及28 d 時P<0.001)。

圖2 兩種不同成瘤方式腫瘤生長情況Note. A, Tumor formed by ectopic xenograft. B,Tumor formed in situ by ectopic xenograft. C,High magnification for the tumor formed by ectopic xenograft. D, Tumor formed by orthotopic xenograft, with reference to the bilateral adrenal glands. E, Tumor formed in situ by orthotopic xenograft, the arrow pointed to the position of the tumor formed. F, High magnification for the tumor formed by ectopic xenograft.Figure 2 Situation of tumor growing by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft

表1 皮下異位移植瘤組和腎上腺原位移植瘤組接種腫瘤細胞后各時間點的成瘤率比較(%)Table 1 Tumor formation rate by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft at the different time points

表2 皮下異位移植瘤組和腎上腺原位移植瘤組腫瘤細胞接種后不同時間點腫瘤體積比較Table 2 Volume of tumor formed by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft at the different time points

2.3 兩種不同成瘤方式腫瘤組織病理特點

與皮下異位移植瘤相比,接種細胞后相同時間點的腎上腺原位移植瘤的腫瘤體積更大(圖3A、3D)。HE 染色可見,原位移植瘤的腫瘤細胞相比與皮下異位移植瘤腫瘤細胞略顯致密,細胞分布更均勻(圖3B、3E)。 原位移植瘤腫瘤細胞的形態與皮下異位移植瘤腫瘤細胞形態相同,呈均質藍染(圖3C、3F)。

圖3 兩組不同成瘤方式腫瘤組織形態及組織學形態照片Note. A, Gross appearance of the tumors formed by the ectopic xenograft. B, HE staining of the tumors formed by the ectopic xenograft. C, HE staining of the tumors formed by the ectopic xenograft. D,gross appearance of the tumors formed by the orthotopic xenograft. E,HE staining of the tumors formed by the orthotopic xenograft. F, HE staining of the tumors formed by the orthotopic xenograft.Figure 3 Gross appearance and the histology of the tumors formed by the orthotopic xenograft and ectopic xenograft

3 討論

NB 是一種起源于神經嵴的兒童顱外惡性實體腫瘤,大部分發生于腹部,最常見于腎上腺,也可發生于交感神經系統存在的任何部位,包括脊柱旁的交感神經節,是兒童腫瘤死亡的最主要原因之一。高危的NB 細胞具有高致瘤性和侵襲性,早期轉移多,約60%~70%的病例發生轉移,成為神經母細胞瘤患者的主要死因[3,6,14]。 因此,NB 的動物模型制備對研究NB 的發生、發展及治療奠定了良好的科研基礎,NB 動物移植瘤模型是NB 研究不可或缺的工具。 NB 皮下異位移植瘤動物模型因其操作簡單易行,廣泛用于NB 的研究,但有其局限性,臨床中約有60%的NB 原發于腹膜后,來源于腎上腺髓質或交感神經節,原位移植瘤動物模型的生物學特性更貼近臨床實際[15]。 目前腎上腺原位移植瘤模型越來越多地成為主流的NB 移植瘤形式,但未見詳細的操作流程作為方法學方面的指導,常規建立標準的NB 移植瘤模型較為困難。 本文詳細介紹了NB 腎上腺原位移植瘤動物模型的造模方法,為今后更加準確、高效的復制此動物模型提供細致和標準化的實驗方案。 對未來進一步研究NB 發生、發展及治療提供了科學的研究工具。

我們在本研究中發現,與皮下異位移植瘤模型相比,腎上腺原位移植模型成瘤速度快、細胞需求量小、腫瘤體積大的優點。 更符合臨床患兒體內NB生長的特點,我們在本研究中觀察到小鼠腎上腺原位移植腫瘤局限于特定位置而且在短期內未發現有轉移形成,更符合NB 在人體內的生長特點,是研究NB 的理想動物模型。 相較于皮下異位移植瘤模型,原位移植瘤模型成瘤率更高,各時間點成瘤率均為100%,腫瘤生長速度快、實驗周期短,在實驗研究中優于皮下異位移植瘤模型[16-17]。

腎上腺原位移植造模方式可行性強,在模型建立過程中需注意:(1)麻醉方式最好選擇氣體麻醉,本實驗在擁有一定操作熟練度的情況下,每只鼠需要麻醉時間短,常規麻醉小鼠蘇醒慢、對機體影響較大,氣體麻醉是目前對于短時間麻醉和反復多次麻醉時首選的麻醉方式。 (2)原位移植時需要注意對脾和腎的保護,由于脾與腎均為質地較脆的實質性器官,不當的操作會對其造成損傷,影響小鼠術后狀態甚至成活率。 盡量使用棉簽一類的柔性物體來觸碰。 (3)保護腎上腺,注射細胞時針尖位置要確保不會碰到腎上腺實質,以免造成小鼠術中死亡。 (4)防止腫瘤細胞漏液,在脂肪層注射細胞時要做到進針既穩又準,注射器針尖不能刺穿脂肪層,盡量使針尖前端多進入脂肪層一段距離,注射時注射位置要能看到皮丘狀隆起,拔針的同時要迅速用棉簽抵住針眼防止漏液。 (5)術后要勤觀察小鼠狀態,原位移植后腫瘤發展迅速,對小鼠生理狀態影響極大,每天稱量體重,觀察毛色等外觀變化。

本研究聚焦NB 原位移植瘤模型造模方法,為準確高效地復制該動物模型提供一種標準化實驗方案,為NB 的研究奠定了良好的科研基礎。