基于灰色關聯度分析綜合評價不同產地牡丹皮藥材質量

張洪坤 黃玉瑤 路麗 楊美華 吳韶輝 高貫彪

(1.亳州市滬譙藥業有限公司，安徽 亳州 236800;2.中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所，北京 100193;3.廣州市中芝源中藥有限公司，廣東 廣州 510925；4.韶關市食品藥品檢驗所，廣東 韶關 512026)

牡丹的藥用價值自先秦開始體現，明確記載“牡丹”始見于《神農本草經》，之后更多古書典籍中提及牡丹的藥用，入藥部位為牡丹皮?！吨腥A人民共和國藥典》(2015版)一部載，牡丹皮為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀的功效[1]，主產于安徽、山東、山西、河南、湖南、湖北、四川、重慶、甘肅、陜西等地。牡丹皮中主含酚類、單萜類等多種成分[2-7]，其成分含量的高低，可直接影響藥材質量?；疑到y理論[8-13]在中藥質量評價中的應用主要是基于中藥樣本各指標成分定量數據，建立灰色關聯度評價模型，計算評價單元序列與參考序列間的相對關聯度，對評價單元進行排序，從而獲得評價結果[14-16]。因此，本研究以17個產地牡丹皮藥材為研究對象，按2015年版《中國藥典》方法測定樣品中浸出物和總灰分含量，采用HPLC分析法同時測定樣品中7成分含量，基于灰色關聯度分析綜合評價不同產地牡丹皮藥材質量。報告如下。

1 材料與方法

1.1儀器 粉碎機、電子天平(百萬分之一，Mettler Toledo)、電子天平(萬分之一，Mettler Toledo)、電熱鼓風干燥箱，電熱恒溫水浴鍋(上海市一恒科學儀器有限公司)，馬弗爐，DIONEX Ultimate 3000高效液相色譜儀(DAD檢測器)、ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(Agilent)。

1.2材料 沒食子酸(110831-201605，純度90.8%，中國食品藥品檢定研究院)；兒茶素(110877-201604，純度99.2%，中國食品藥品檢定研究院)；氧化芍藥苷(MUST-16021505，純度99.93%，成都曼斯特有限公司)；芍藥苷(110736-201539，純度96.4%，中國食品藥品檢定研究院)；苯甲酸(100419-200301，中國食品藥品檢定研究院)；丹皮酚(110708-201407，純度99.9%，中國食品藥品檢定研究院)；苯甲酰芍藥苷(MUST-16061803，純度99.28%，成都曼斯特有限公司)。甲醇為色譜純(Merck)；磷酸為色譜純(阿拉丁)；其余試劑為分析純。牡丹皮藥材于2017年先后自安徽、山東、山西、湖南、湖北、河南、甘肅、陜西、四川等牡丹皮主產區收集，經河南中醫藥大學張振凌教授鑒定為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr.的干燥根皮，樣品來源信息見表1。

表1 不同產地牡丹皮藥材來源信息

1.3方法

1.3.1理化指標 按2015年版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定法(熱浸法)、總灰分測定法測定。結果見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.3.2多成分含量測定 本研究參照本項目研究成果《牡丹皮不同采收期質量綜合評價研究》[17]、《不同產地牡丹皮規格等級內涵研究》[18]一文中所述的含量測定方法，方法學考察內容不再贅述。(1)對照品溶液制備:取對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，得質量濃度分別為沒食子酸0.5 mg/mL、兒茶素0.5 mg/mL、氧化芍藥苷0.3 mg/mL、芍藥苷1.0 mg/mL、苯甲酸0.5 mg/mL、丹皮酚1.0 mg/mL和苯甲酰芍藥苷0.5 mg/mL的單個對照品溶液。分別精密移取上述各對照品溶液適量，加50%甲醇稀釋，得質量濃度分別為0.0 036 mg/mL、0.0 030 mg/mL、0.0 126 mg/mL、0.0 194 mg/mL、0.0 020 mg/mL、0.0 501 mg/mL、0.0 051 mg/mL的混合對照品溶液。(2)供試品溶液制備：取過3號篩的樣品粉末，約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，回流提取1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(3)色譜條件：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5μm)；檢測器：DAD檢測器；檢測波長：230 nm，258 nm(氧化芍藥苷)；流動相：以甲醇為流動相A，以0.1%磷酸水溶液為流動相B，按表2中的規定進行梯度洗脫；流速：1 mL/min；進樣量：10μL；柱溫：30℃。在此色譜條件下，取對照品、供試品溶液適量，分別進樣10μL測定，HPLC色譜圖見圖1。

注：A.對照品；B.供試品；1.沒食子酸；2.兒茶素；3.氧化芍藥苷；4.芍藥苷；5.苯甲酸；6.丹皮酚；7.苯甲酰芍藥苷。圖1 HPLC色譜圖

2 方 法

2.1線性關系考察 分別精密吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、3、5、7、10、15μL，在“2.2.3”項色譜條件下進樣檢測分析，以對照品的量為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。見表3。

表3 7種對照品的線性關系

2.2牡丹皮樣品各指標成分含量測定 取不同產地牡丹皮樣品，分別按“2.1”、“2.2”、項下分析方法測定浸出物、總灰分、以及沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚和苯甲酰芍藥苷的含量。見表4。

表4 牡丹皮樣品9種指標成分的含量測定結果(n=3)

2.3建立評價牡丹皮藥材質量的灰色關聯度模式 本研究參照本項目研究成果《牡丹皮不同采收期質量綜合評價研究》[17]、《不同加工方法牡丹皮中7種指標性成分的含量測定及質量評價》[19]、及其他文章中所述的灰色關聯度方法，進行灰色關聯度方法的建立。

2.3.1數據標準化 將原始數據集進行規格化處理。見表5。

表5 不同產地牡丹皮原始數據規格化處理

表6 評價單元序列相對于最優參考序列的關聯系數

表7 評價單元序列相對于最差參考序列的關聯系數

2.3.3關聯度與相對關聯度的計算 計算各評價單元相對于最優參考序列和最差參考序列的關聯度ri(s)、ri(t)，以及17個批次牡丹皮樣品的相對關聯度ri，并進行質量排序，結果見表8。

2.3.4牡丹皮藥材質量評價 相對關聯度ri與牡丹皮藥材的質量評價成正相關，ri排序結果可作為藥材質量高低評價的依據。由表9可見，17個產地牡丹皮樣品的相對關聯度在0.314～0.597之間，其中6個產地樣品的相對關聯度>0.50，5個產地樣品的相對關聯度在0.45～0.50之間，6個產地樣品的相對關聯度<0.45，表明不同產地牡丹皮藥材質量存在差異。山西運城絳縣(S07)、山西運城聞喜(S06)、安徽銅陵(S01)、安徽南陵(S09)和陜西商洛(S15)的相對關聯度分別為0.597、0.583、0.546、0.537、0.532，排名前5位。湖北恩施利川(S10)、重慶墊江(S17)、亳州十九里(S03)、亳州五馬(S04)、亳州華佗(S02)和山東菏澤(S05)的相對關聯度分別為0.414、0.401、0.392、0.381、0.376、0.314，排名后6位。

3 討 論

本研究建立了HPLC分析法同時測定牡丹皮藥材中沒食子酸等7成分的含量測定方法，該方法經方法學驗證，可用于牡丹皮質量評價研究，為牡丹皮多指標質量控制方法的建立提供一些理論參考。

本次研究共采集了17個產地的牡丹皮藥材，以其沒食子酸、兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷、苯甲酸、丹皮酚、苯甲酰芍藥苷、浸出物和總灰分倒數為綜合評價指標，采用GRA法處理數據，計算相對關聯度作為測度，評價各產地牡丹皮樣品，能夠相對客觀全面地反映牡丹皮藥材的內在質量，從而實現牡丹皮藥材的合理評價。各產地牡丹皮藥材相對關聯度：山西運城聞喜>山西運城絳縣>安徽銅陵>安徽南陵>陜西商洛>河南焦作孟州>陜西安康>四川達州>湖南邵陽>甘肅永登>甘肅天水>湖北恩施利川>重慶墊江>亳州十九里>亳州五馬>亳州華佗>山東菏澤。

本研究結果表明不同產地牡丹皮藥材質量存在差異。山西運城產地牡丹皮藥材中兒茶素、氧化芍藥苷、芍藥苷和浸出物含量明顯高于其他產地，其藥材質量評價關聯度最高；安徽銅陵、南陵所產的牡丹皮藥材質量排序第3、第4名，說明其藥材整體關聯度較高，同時安徽銅陵和南陵為牡丹皮的道地產區。

中藥牡丹皮是一個復雜的藥材，成分的多樣性致使其質量很難控制，單一的指標成分不能準確反映中藥的藥效和質量，使其在分析評價中藥的質量時損失信息量太多。而中藥質量評價數據的深度挖掘顯得尤為重要[20]?；疑P聯度分析法可以深度挖掘原始信息下所隱藏的關聯，整體性強，適合于分析成分復雜的中藥?；诨疑P聯分析法的特點，本研究以相對關聯度為測度，構建一種牡丹皮藥材質量綜合評價模型，客觀地反映了牡丹皮藥材的內在質量，為牡丹皮藥材的綜合質量評價提供了新思路，求購者可以參考本文的結果根據實際需要選擇不同產地的牡丹皮，也為牡丹皮資源的開發利用提供了參考依據。