優化流式細胞儀濾光片配置的探索

張穎

（華東師范大學，上海 200241）

流式細胞儀(Flow Cytometer，FCM)是一種對懸浮液中處于高速且直線流動的單細胞或顆粒，實現高速且單細胞的多參數定量分析或分選的儀器。同時，對單個細胞（顆粒）進行多參數、快速、準確、高精度的分析（選）的功能，已經成為當前先進的細胞（顆粒）定量分析技術。

1 流式細胞儀的工作原理

液流系統、光學檢測系統、電子控制系統、數據儲存與分析系統構成了流式的分析儀，具有分選功能的流式細胞儀還包括分選系統。在一定的壓力下，懸浮的細胞或顆粒進入鞘液，通過動力學聚焦作用居于鞘液流中心，鞘液包裹著細胞或顆粒通過噴嘴中心進入流動室，在流動式的分析點，激光照射到細胞（顆粒）上，發生光的散射、反射、折射；細胞所攜帶的熒光素被激光激發，發出不同波長的熒光。散射光、不同波長的熒光，通過不同的濾光片分配到光電倍增光檢測器（PMT）上，散射光被PMT轉化為電信號，熒光則被聚光器收集，PMT將熒光信號對數放大，轉化成電信號。散射光信號和熒光信號經放大后，再經過數據化處理輸入電腦并儲存。分選系統目前是在流式細流動室的出口噴嘴上安裝的壓電晶片，根據光學信號的反饋使液流束解離出單細胞液滴并帶上相應電荷。帶電液滴進入一個恒定靜電場后發生方向偏轉，包含目標細胞的液滴流入收集容器。

2 流式細胞儀的光學系統及濾光片

光學系統是流式細胞儀的核心結構之一，包括光源和信號接收系統。光源是指激光器；流式細胞儀對細胞及微粒的檢測是通過對光信號的收集實現的，包括散射光信號和熒光信號的檢測。

流式細胞儀的光學系統是由激光器、若干組透鏡、小孔和一系列的濾光片等組成。熒光分光系統是由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號傳送到相應的PMT上。濾光片主要有三類：短通濾光片（Shortpass filter）：小于特定波長的光信號通過；長通濾光片（Long-pass filter）：大于特定波長以上的光信號通過。帶通濾光片（Band-pass filter）：只允許一定的波段范圍內特定波長的光信號通過。不同的濾光片組合可以將不同波長的熒光信號傳送到相應的PMT上。

3 流式細胞儀原濾光片配置的局限性及優化的必要性

熒光素光的強度有強弱之分，單熒光素的選擇標記的流式抗體一般盡量選擇熒光較強的熒光素，只要在儀器的檢測范圍，受濾光片配置影響較小；多熒光素組合的流式實驗在熒光素的選擇上優先考慮的是樣本表面或者內部各種抗原表達量的不同。表達高的抗原選擇較弱熒光素標記的抗體，而表達量低的抗原則要選擇強熒光素標記的抗體。但在10種熒光素以上的流式檢測設計方案，低表達的檢測標記多，儀器原有配置不能滿足檢測需求。

目前，流式細胞儀配有多個熒光檢測器，可以同時檢測多種熒光。每個熒光檢測器只允許一種特定波長的熒光信號通過并被檢測到，因此我們必須選擇適當的信號接收器，才能收到最佳信號，儀器的濾光片的配置決定了哪些信號通道可以被檢測到。在進行流式的多色分析實驗時，如果想得到理想的檢測結果，就必須選擇最佳的熒光素抗體搭配。在檢測過程中，由于儀器出廠時間比較久，濾光片配置根據當時在市場上應用的熒光素種類進行設置，但隨著科技的進步，新熒光素不斷被開發出來并應用到流式熒光抗體中，儀器老舊的配置使很多新染料得不到應用，影響科學研究的多色檢測實驗的步伐。

科學研究的多色檢測實驗，受限于儀器的出廠配置，熒光素的顏色搭配不能達到最佳，就會產生大量的熒光溢漏，必須進行補償的調節，帶來大量的額外工作。為解決上述問題，我們仔細研究了流式細胞儀的配置，探索通過優化濾光片的搭配，使光路系統的配置更加靈活，建立可實現多種熒光素檢測且盡可能少補償調節的配色方案。實現檢測多色流式細胞實驗的目的。以流式細胞技術平臺的BD LSR Fortessa優化405激發光的熒光檢測通道為例，出廠儀器配置如圖所示1。

在研究光學系統時，我們發現激光接收盤的結構放置濾光片的位置有頂簧，濾光片的架子規格是固定的，這可以保證濾光片插進去的角度不變，流式細胞儀固定的校準光路設計，保證了激光的接收效果。根據光的性質性的理論分析，利用流式細胞儀熒光接受盤的結構設計特點，我們定制濾光片，優化儀器光學系統，根據實際檢測工作的需要靈活地組合搭配濾光片。

由圖1我們可知，原405激光器的有6個檢測器可接受并檢測熒光信號，長通570nm和帶通586/15nm組合名為Qdot585的通道與長通為535nm帶通為540/30nm名為Qdot565的通道，接受熒光信號波段差小，產生的熒光補償大；而且市場上Qdot585同波段的熒光素抗體應用較少。經市場和用戶使用調研，根據實驗需求，進行光學系統優化搭配組合濾光片，改善儀器配置，定制750nm長通濾光片和帶通為780/60nm的帶通濾光片，搭配使用，引入熒光強度較強，與其他熒光通道波段差異大，相互產生溢漏小，且標記抗體多的BV785（6）熒光素所需750～810nm通道取代Qdot585通道。

圖1 原儀器405nm激光接受器配置

將定制濾光片750nm的長通濾光片和780/60nm的帶通濾光片置于405nm激發光接收器的A位置，如圖2所示，根據光的波段從長到短的行走路徑和光性質，重新布局各濾光片的分布，如圖2所示。在儀器上重新布局濾光片后，需在軟件里重新設置新的“Configration”，405nm激光器激發的熒光接受通道布局按圖2進行設置。在新的“Configration”下通過質量控制監測后，發現儀器性能各項指標正常通過質控，未因濾光片的重新布局，受到影響。我們進行BV785（6）熒光素的檢測，該通道無論是單色BV786熒光素檢測，還是多色的染色方案中都可以檢測到BV786熒光素抗體標記的細胞亞群，如圖3所示。

圖2 405nm激光接受器濾光片的新布局

圖3 優化的BV786檢測通道

4 結語

優化濾光片配置，對其進行靈活的組合，引入新的熒光檢測通道，減少了多色檢測實驗中的熒光補償，在多色的實驗設計及檢測過程中節省實驗費用和時間成本。我們對流式細胞儀405nm激光器的一個通道的濾光片進行優化的探索，其他檢測通道及其他激光器檢測通道的濾光片的優化提供了可循的方案，為多色檢測在科研的廣泛應用貢獻了一份力量。