曹 穎，朱 飛，霍立茹，*

1 徐州醫(yī)科大學(xué)，徐州 221000；2 南京濟(jì)群醫(yī)藥科技股份有限公司，南京 211100

莫西沙星作為第四代喹諾酮類抗菌藥，臨床應(yīng)用為鹽酸鹽的形式。其在前三代藥物的基礎(chǔ)上進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，具有抗菌譜廣、抗菌能力強(qiáng)、療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，因此在臨床得到廣泛的應(yīng)用[1]。在鹽酸莫西沙星合成工藝中用到了2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯，此為潛在遺傳毒性雜質(zhì)[2]。該類雜質(zhì)在極微量的水平就能誘導(dǎo)DNA 發(fā)生突變，嚴(yán)重威脅人類的健康，因此有必要建立鹽酸莫西沙星中2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的檢測(cè)方法。

酰氯類化合物的性質(zhì)非?；顫?，原型結(jié)構(gòu)不易直接檢測(cè)[3]，目前文獻(xiàn)報(bào)道中多采用衍生化法對(duì)酰氯進(jìn)行測(cè)定[4-9]。主要有水解法和醇解法，使酰氯結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸和酯進(jìn)行檢測(cè)；但是醇解法對(duì)反應(yīng)體系中的含水量要求較高，必須嚴(yán)格控制操作環(huán)境以及樣品中的水分，檢測(cè)比較復(fù)雜。此外，根據(jù)EMA、美國(guó)FDA 以及ICH M7[10-12]中相關(guān)指導(dǎo)原則要求，遺傳毒性雜質(zhì)的毒理學(xué)關(guān)注閾值（TTC）為1.5 μg/天。莫西沙星制劑一般日最大使用劑量為400 mg，所以鹽酸莫西沙星中2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的限度為3.75 ppm，限度很低，普通的液相色譜方法達(dá)不到靈敏度要求，目前尚未見(jiàn)到鹽酸莫西沙星中酰氯類遺傳毒性雜質(zhì)研究的相關(guān)報(bào)道。

本文采用LC-MS/MS 法，以水解法對(duì)2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯進(jìn)行衍生化后測(cè)定，操作簡(jiǎn)單，不僅滿足了遺傳毒性雜質(zhì)痕量研究中的高靈敏度要求，也解決了酰氯結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性對(duì)測(cè)定帶來(lái)的影響，同時(shí)也為其他酰氯類物質(zhì)的檢測(cè)提供參考。

1 材 料

1.1 儀器

U3000 高效液相色譜儀（Thermo-Fisher)；API 4000 三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀（AB Sciex）；CPA225D 電子分析天平（精度：0.01 mg），賽多利斯；MSA6.6S 電子分析天平（精度：0.001 mg），賽多利斯。

1.2 藥品與試劑

2，4，5-三 氟-3-甲氧基苯甲酰氯（批號(hào)：1772231M-SY-01，純度：97.9%）（深圳市斯坦德華工科技有限公司）；鹽酸莫西沙星原料藥（批號(hào)：MX1712001、MX1712002、MX1712003）（南京濟(jì)群醫(yī)藥科技股份有限公司）。

甲酸（批號(hào)：6F2941）（ROE）；甲醇（批號(hào)：I0887507717，Merck）為色譜級(jí)；乙腈（批號(hào)：1823829614，Merck）為質(zhì)譜級(jí)。試驗(yàn)水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 液相色譜-質(zhì)譜條件

2.1.1 液相色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸（75∶25）；柱溫：40 ℃；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：5 μL；分析時(shí)間：5 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件 選用電噴霧離子源（ESI），設(shè)定源參數(shù)分別為：噴霧電壓-4200 V，輔助氣150 Pa，輔助氣250 Pa，輔助氣加熱溫度450 ℃，氣簾氣20 Pa，碰撞氣1 Pa。

設(shè)定Q0 入口電壓為-10V，Q2 出口電壓為-15V。負(fù)離子檢測(cè)模式，MRM：205.0/160.8，去簇電壓為-30 V，碰撞電壓為-14 eV。

2.2 衍生化條件

將水作為衍生化試劑，取鹽酸莫西沙星約20mg，置10 mL 量瓶中，加1 mL 水使溶解，室溫條件下超聲5 min，將鹽酸莫西沙星中可能存在的2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯轉(zhuǎn)化為性質(zhì)更穩(wěn)定的2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸來(lái)進(jìn)行測(cè)定。

2.3 溶液配制及檢測(cè)

取2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯約1 mg，精密稱定，置10 mL 量瓶中，加水溶解超聲振蕩5 min并稀釋至刻度，作為對(duì)照品貯備液；精密量取對(duì)照品貯備液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋成2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的濃度約為0.5、1、2、5、10、20 ng·mL-1的系列溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

取鹽酸莫西沙星原料藥約20 mg，置10 mL 量瓶，加1 mL 水，室溫條件下超聲振蕩5 min，再用甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。

精密量取標(biāo)準(zhǔn)溶液與供試品溶液各5 μL，分別進(jìn)樣測(cè)定，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

2.4 分析方法驗(yàn)證

2.4.1 質(zhì)譜分析 負(fù)離子模式下在2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯水解衍生物（2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸）準(zhǔn)分子離子峰（M-H-）為m/z=205.0，在其二級(jí)裂解質(zhì)譜圖中，豐度最強(qiáng)的子離子峰為m/z=160.8，為2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸脫去羧基（-COOH）所形成的，裂解質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸m/z=160.8 的二級(jí)裂解質(zhì)譜圖

2.4.2 專屬性試驗(yàn) 在所建立的色譜和質(zhì)譜條件下，2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的水解衍生物2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸的保留時(shí)間為0.99min，空白溶劑在此處無(wú)峰檢出，對(duì)2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的測(cè)定無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。見(jiàn)圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)圖譜

2.4.3 定量限與檢測(cè)限設(shè)立 取上述“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋成一定濃度的溶液，分別以信噪比S∶N=10∶1 及3∶1 時(shí)的濃度作為定量限及檢測(cè)限，結(jié)果該方法下2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的定量限濃度為0.40 ng·mL-1（相當(dāng)于供試品濃度的百分比為0.20 ppm）；檢測(cè)限濃度為0.080 ng·mL-1（相當(dāng)于供試品濃度的百分比為0.04 ppm），這表明2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的定量限濃度明顯低于限度濃度（3.75 ppm），方法靈敏度符合要求。

2.4.4 線性與范圍 精密量取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加甲醇稀釋成濃度分別為0.485、3.856、4.627、7.712、11.569、15.425 ng·mL-1的系列溶液，取各溶液5 μL，按“2.1”項(xiàng)下液質(zhì)條件進(jìn)樣，以2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯的濃度C（ng·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酸的峰面積A為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸?；貧w方程為：Y=3.82×104X-1.439×103，r=0.999 9，這表明2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯在0.485～15.425 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，加甲醇逐級(jí)稀釋成濃度約為75 ng·mL-1的溶液，作為回收率外加對(duì)照品貯備液。另取鹽酸莫西沙星原料約20 mg，置10 mL 量瓶中，平行配制3 份，分別加1 mL 水超聲使溶解，再分別精密量取對(duì)照品貯備液0.5、1.0、1.5 mL，置上述10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，平行配制3 份。分別精密量取各溶液5 μL 進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下液質(zhì)條件檢測(cè)。結(jié)果表明，2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯回收率在101.6%～111.2%，RSD 為3.7%，符合要求。見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4.6 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密量取濃度約為75 ng·mL-1的回收率外加對(duì)照品貯備液5 μL，按“2.1”項(xiàng)下液質(zhì)條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，結(jié)果2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯水解物峰面積的RSD 為2.1%（n=6），表明儀器進(jìn)樣精密度良好。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法，平行配制6份供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下液質(zhì)條件檢測(cè)，結(jié)果6份樣品均未檢出雜質(zhì)。

另配制含2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯約7.5 ng·mL-1的供試品溶液6 份，按“2.1”項(xiàng)下液質(zhì)檢測(cè)，以含量結(jié)果的RSD 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。6 份樣品的含量均為0.0004%，RSD 為3.0%，表明方法重復(fù)性符合要求。

2.5 樣品雜質(zhì)檢測(cè)

取鹽酸莫西沙星原料藥3 批，按照“2.3”項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下液質(zhì)條件分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算酰氯殘留量。結(jié)果3 批原料藥中均未檢出2，4，5-三氟-3-甲氧基苯甲酰氯。

3 討論

3.1 衍生化時(shí)間和溫度的考察

采用水解法對(duì)酰氯進(jìn)行衍生化，以水超聲溶解樣品的方式使酰氯結(jié)構(gòu)水解成羧酸進(jìn)行檢測(cè)。考察了不同溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃）對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，以回收率為指標(biāo)來(lái)考察酰氯是否完全轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的羧酸，結(jié)果表明，溫度對(duì)衍生化反應(yīng)幾乎沒(méi)有影響，故選擇在室溫條件下進(jìn)行衍生化反應(yīng)。

在室溫條件下，考察了反應(yīng)時(shí)間（3、5、7、10、15 min），同樣以回收率作為考察指標(biāo)。結(jié)果表明一般室溫條件下超聲3～15 min 該酰氯雜質(zhì)均能水解完全。為了實(shí)驗(yàn)操作的方便性，選擇室溫條件下超聲5 min 作為衍生化的條件

3.2 液相色譜條件的確定

考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和甲醇-0.1%甲酸水溶液等不同的流動(dòng)相組成，以及有機(jī)相比例（50%、60%、75%），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，75%乙腈時(shí)的雜質(zhì)響應(yīng)和峰形較好，流動(dòng)相中加入甲酸對(duì)峰形有改善作用且未對(duì)離子化效率產(chǎn)生不利影響，有機(jī)相的比例提高也有利于離子化效率的提高，從而得到更高的靈敏度。故選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液（75∶25）作為流動(dòng)相。

在進(jìn)行回收率試驗(yàn)時(shí)，供試品溶液直接全部以水做溶劑時(shí)，因離子化效率低導(dǎo)致回收率偏低，采用先加適量水超聲溶解后，再以甲醇稀釋至所需濃度的方式，離子化效率明顯提高。

綜上，本方法能夠?qū)}酸莫西沙星中的酰氯類遺傳毒性雜質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，能滿足遺傳毒性雜質(zhì)痕量研究的要求，可作為鹽酸莫西沙星中的酰氯類雜質(zhì)的質(zhì)量控制方法。