花椒與辣椒協(xié)同抗氧化作用評價研究

彭青，盧云浩，何強

(四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065)

亞硝酸鹽作為防腐劑和發(fā)色劑被廣泛應用于肉制品加工，當以活性亞硝酸和一氧化氮形式存在時，與次級胺類物質(zhì)生成具有強致癌性的亞硝胺類化合物[1]；自由基在人體代謝中失衡時，同樣會導致人體正常細胞和組織損壞，引起多種疾病，而對人體健康產(chǎn)生危害[2]。研究表明，維生素、酚類、類黃酮等天然抗氧化劑可清除自由基或抑制電子傳遞，并能有效阻斷亞硝酸根與仲胺的結(jié)合生成N-亞硝胺[3-4]，從而有益人體健康。此外, 不同抗氧化劑之間存在一定的協(xié)同效應, 按不同比例將單一的抗氧化劑混合使用可以達到更理想的抗氧化效果[5]。

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim.)和辣椒(CapsicumannuumL.)廣泛分布于中國西南等地，作為傳統(tǒng)的藥食兩用香辛料，被大量混合使用于餐桌調(diào)味。研究發(fā)現(xiàn)花椒、辣椒中富含生物堿、多酚、辣椒素、類胡蘿卜素等多種生物活性成分，具有抗癌、抗氧化、抗菌等多種藥理作用[6-9]。目前，對于兩者聯(lián)合使用的抗氧化能力尚不明確。因此，本研究基于花椒和辣椒飲食的烹飪工藝，采用不同的浸提工藝提取兩者的活性物質(zhì)，基于NO2-·、DPPH·、ABTS+·自由基體外清除模型，探討了花椒和辣椒協(xié)同抗氧化的作用效果，以期為合理搭配花椒與辣椒用于食品抗氧化以及人體健康提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

漢源紅花椒、紅辣椒：購于當?shù)爻校换前贰Ⅺ}酸萘乙二胺、DPPH、ABTS：購自Sigma公司(中國上海)；亞硝酸鈉、過硫酸鉀：購自成都科龍化工試劑廠；UV2000紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；SOQ電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司；KQ3200DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 花椒-辣椒水提取物(ZCW)制備

原料經(jīng)粉碎過40目篩后，分別稱取30 g花椒粉、辣椒粉、混合粉末(2∶1,W/W)于1000 mL沸水中蒸煮2 h，離心，然后將上清液旋蒸并用蒸餾水定容到100 mL容量瓶中，分別得到花椒水提物(ZW)、辣椒水提物(CW)和花椒-辣椒混合水提物(ZCW)。

1.2.2 花椒-辣椒醇提取物(ZCE)制備

原料經(jīng)粉碎過40目篩后，分別稱取30 g花椒粉、辣椒粉、混合粉末(2∶1,W/W)于1000 mL無水乙醇中加熱回流提取2 h，離心，然后將上清液旋蒸并用乙醇定容到100 mL容量瓶中，得到花椒醇提物(ZE)、辣椒醇提物(CE)和花椒-辣椒混合醇提物(ZCE)。

1.3 亞硝酸鹽清除能力測定

亞硝酸鹽清除能力的測定采用Griess reagent法[10]。取1 mL稀釋至一系列濃度梯度的提取樣液(0.2～1 mg/mL)與1 mL 1 mmol/L NaNO2和8 mLpH 3.0的檸檬酸鈉緩沖液混合，于37 ℃水浴中反應2 h，得試樣反應液，不加提取物作為對照組。取1 mL試樣反應液加入1.5 mL Griess I試劑(磺胺5 g/L)于室溫反應5 min后，加入1.5 mL Griess II試劑(鹽酸萘乙二胺1 g/L)于室溫繼續(xù)反應5 min，于538 nm處測定吸光度。

亞硝酸鹽清除率(%)=(A0-A1)/A0×100%。

式中：A0為對照組吸光度，A1為實驗組吸光度。

1.4 DPPH自由基清除能力測定

配制DPPH自由基工作液[11]，取2 mL稀釋至一系列濃度梯度的提取物(0.02～0.1 mg/mL)與2 mL DPPH溶液混合，在25 ℃避光孵育30 min，于517 nm處測定反應液的吸光度，以95%乙醇代替提取物做空白對照。DPPH自由基清除率的計算同1.3。

1.5 ABTS自由基清除能力測定

配制ABTS自由基工作液，取0.1 mL稀釋至一系列濃度梯度的提取物(0.2～1 mg/mL)同3.9 mL ABTS自由基工作液混合，在25 ℃條件下孵育6 min，于734 nm處測定反應液的吸光度，以純水代替提取液做空白對照。ABTS自由基清除率同1.3。

1.6 花椒和辣椒提取物協(xié)同抗氧化效果評價

本文采用Chou-Talalay法對花椒和辣椒提取物協(xié)同抗氧化效果進行評價[12]。

1.6.1 中值效應方程

中效方程：Fa/Fu=(D/Dm)m。

式中：D為藥物濃度；Fa為D濃度下物質(zhì)的清除率；Fu=1-Fa；Dm為中效濃度(IC50)，是清除率50%時的濃度；m為量效關(guān)系曲線的系數(shù)。

1.6.2 聯(lián)合指數(shù)(CI)

將中值效應方程應用到兩種物質(zhì)的聯(lián)合使用，Chou和Talalay提出聯(lián)合指數(shù)CI來量化兩種物質(zhì)的協(xié)同或拮抗作用:

式中：D1、D2為聯(lián)合使用時產(chǎn)生清除率X效應兩物質(zhì)各自所需劑量。Dx1、Dx2為兩物質(zhì)單用時產(chǎn)生清除率X效應各自劑量。CI=1，CI<1和CI>1分別表示兩物質(zhì)具有相加作用、協(xié)同作用、拮抗作用。

1.6.3 劑量減少指數(shù)(DRI)

物質(zhì)聯(lián)合使用前后的劑量變化幅度是評價聯(lián)合使用效果的重要指標，用來衡量相同作用水平下，協(xié)同使用時相比單獨使用時每種物質(zhì)劑量降低的倍數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0進行數(shù)據(jù)分析，其中方差分析采用單因素-鄧肯分析，Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物對NO2-·、DPPH·和ABTS+·的清除效果比較

各提取物對NO2-·、DPPH·和 ABTS+·的清除能力及IC50值見圖1和表1。

表1 各提取物清除NO2-·、 DPPH·和ABTS+·自由基的IC50值Table 1 IC50 values of extracts scavenging NO2-·,DPPH·and ABTS+ ·free radicals

圖1 提取物對NO2-·(a)、DPPH·(b)和ABTS+·(c)清除濃度-效應圖Fig.1 The scavenging concentration-effect diagram of extracts on NO2-·(a), DPPH·(b) and ABTS+·(c)

由圖1可知，各提取物對NO2-·、DPPH·和ABTS+·的清除能力呈一定的量效關(guān)系，清除效果均隨濃度增大而增大，表明各提取物均具有良好的抗氧化活性，且醇提物的抗氧化活性優(yōu)于水提物。在亞硝酸鹽體系中，單獨使用花椒水提物ZW(400 μg/mL)和辣椒水提物CW(200 μg/mL)的清除率分別為46.23%和10.39%，而聯(lián)合花椒-辣椒水提取物ZCW(600 μg/mL)的清除率為65.88%，大于兩者單獨作用之和，且優(yōu)于600 μg/mL ZW的單獨作用(50.76%)，說明混合使用花椒和辣椒(2∶1,W/W)對亞硝酸鹽的清除效果更顯著，呈現(xiàn)協(xié)同作用。DPPH·和ABTS+·體系中呈現(xiàn)出了類似的結(jié)果。

由表1可知，各提取物的抗氧化能力存在顯著性差異(p<0.05)，在NO2-·和DPPH·清除體系中，各提取物抗氧化活性強弱為ZCE>ZCW>ZE>ZW>CE>CW；ABTS自由基體系中為ZCE>ZE>ZCW>ZW>CE>CW。

2.2 聯(lián)合提取物ZCW和ZCE對NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除效果相互作用分析

聯(lián)合指數(shù)CI是用于評價物質(zhì)間的相互作用最簡便可行的定量方法，CI<1物質(zhì)間呈協(xié)同作用，反之，呈拮抗作用。在NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除體系中，ZW和CW、ZE和CE在低濃度時(清除率小于10%時)呈現(xiàn)拮抗作用；而當清除率大于10%時，聯(lián)合水提物和醇提物均具有協(xié)同清除NO2-·、DPPH·和ABTS+·的作用(見圖2中 a～c)。

圖2 ZCW、ZCE對NO2-·(a)、DPPH·(b)和ABTS+·(c)清除相互作用聯(lián)合指數(shù)圖Fig.2 The combined index diagram of interactions of ZCW and ZCE scavenging NO2-·(a), DPPH·(b) and ABTS+·(c)

低濃度時，體系中抗氧化劑的氫原子與極性溶劑或其中一些抗氧化劑形成氫鍵，使得周圍的氫原子產(chǎn)生兩個膨脹的雜原子，導致空間大量堵塞，其他游離的抗氧化劑無法接觸和清除自由基，從而產(chǎn)生拮抗作用[13]。此外，由圖2可知，隨著清除效果的增加，CI值呈逐漸降低的趨勢，表明隨著濃度增加，混合提取物的協(xié)同作用越強。且在NO2-·、DPPH·體系中，ZCE的協(xié)同抗氧化效果較ZCW強，而ABTS+·體系中則相反。推測是界面效應引起的，ABTS+·是水溶性自由基，花椒-辣椒聯(lián)合水提物和ABTS聚集形成雙水界面，醇提物則可能由于溶劑效應，影響分子間排列的有序性，沒有與ABTS形成良好的雙水界面，而與脂溶性自由基DPPH形成油油界面，與NO2-·形成油水界面，達到協(xié)同抗氧化效果。

根據(jù)表1結(jié)果以及劑量效應關(guān)系繪制等效應圖，橫軸分別標記花椒提取物清除效應為50%、75%、90%的濃度值(ED50、ED75、ED90)，縱軸分別標記辣椒提取物達到相應清除效應的濃度值(ED50、ED75、ED90)，連接兩兩濃度值構(gòu)成相加線，當花椒-辣椒聯(lián)合提取物達到相應清除效應的劑量濃度在相加線下方，表明聯(lián)合提取物具有協(xié)同作用；處于相加線上表示加和作用；處于相加線上方表示拮抗作用。

由圖3可知，NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除體系中，當花椒-辣椒聯(lián)合提取物清除效應為50%、75%和90%時，聯(lián)合提取物ZCW(見圖3中a～c)和ZCE(見圖3中A～C)數(shù)據(jù)點均落在了斜邊之下，進一步說明聯(lián)合使用呈現(xiàn)協(xié)同抗氧化效果。原因可能是花椒-辣椒聯(lián)合提取物中的維生素C再生了槲皮素或蘆丁，從而使體系形成一個循環(huán)的氧化還原系統(tǒng)；辣椒素能夠再生維生素E、酚酸氧化偶聯(lián)類胡蘿卜素，使得整個體系的抗氧化能力增強，達到協(xié)同抗氧化效果[14-15]。且可以從圖3中看到在達到相同清除效果條件下花椒-辣椒聯(lián)合提取物的使用劑量低于花椒和辣椒單獨提取物的使用劑量。

圖3 ZCW和ZCE對NO2-·(a和A)、DPPH·(b和B)和ABTS+·(c和C)清除等效應圖

2.3 提取物對NO2-·、DPPH·和ABTS+·清除效果劑量減少指數(shù)

DRI值越大，說明聯(lián)合使用時該物質(zhì)的使用劑量降低程度越明顯，同時也降低該物質(zhì)對機體的毒性。由圖4中a可知，亞硝酸鹽體系中，CW的log DRI高于ZW的log DRI，說明聯(lián)合使用ZCW中CW的單一用量減少程度較ZW明顯；而隨著作用效果的增加，其log DRI在減少，說明其單一用量減少程度不呈增大的趨勢；由圖4中A可知，ZE和CE的log DRI均隨作用效果的增加而增大，說明聯(lián)合使用ZCE中，ZE和CE的單一用量減少程度呈增大的趨勢，且CE的減少程度較ZE明顯。

圖4 ZCW和ZCE對NO2-·(a和A)、DPPH·(b和B)和ABTS+·(c和C)清除效應與劑量減少指數(shù)對數(shù)圖Fig.4 Fa-log DRI plots of ZCW and ZCE scavenging NO2-·(a and A),DPPH·(b and B) and ABTS+·(c and C)

DPPH自由基清除體系中，CW、ZW的log DRI均大于0，且CW的log DRI隨著作用效果增大不斷增大，說明ZCW聯(lián)合使用提取物中對CW的用量減少倍數(shù)比較明顯(見圖4中b)。ZE和CE的log DRI均穩(wěn)定在0.5和0.25附近，但CE的log DRI大于ZE，說明聯(lián)合使用的ZCE提取物對CE的使用量減少程度較ZE大(見圖4中B)。

ABTS自由基清除體系中，CW的log DRI大于ZW的log DRI，并隨著清除效應增大而緩慢上升，說明聯(lián)合使用中CW的用量減少程度較ZW明顯(見圖4中c)。ZE和CE的log DRI均隨清除能力的增加而增加，說明在ABTS體系中，CE和ZE的使用量在聯(lián)合使用中均一定程度地減少(見圖4中C)。以上分析進一步說明花椒和辣椒提取物具有協(xié)同抗氧化效果。

3 結(jié)果

本研究發(fā)現(xiàn)花椒和辣椒的醇提取物和水提取物對亞硝酸鹽、DPPH和ABTS自由基清除活性存在較大差異，花椒和辣椒醇提取物的清除活性分別優(yōu)于水提取物，當對兩者進行配比聯(lián)合提取后，表現(xiàn)出了一定程度的協(xié)同抗氧化作用，且在不同的抗氧化體系中，花椒-辣椒聯(lián)合水提物和醇提取物的協(xié)同抗氧化效果不一。研究為食品加工領(lǐng)域?qū)τ趤喯跛猁}的清除和典型香辛料的聯(lián)合使用提供一定指導，奠定科學基礎(chǔ)。