納豆枯草芽孢桿菌對老陳醋中阿魏酸的影響

董紅兵,蔡凱,黃程,龔元元,汪超,祁勇剛,張亮子*

(1.武漢商學院 食品科技學院，武漢 430056；2.湖北工業大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心，武漢 430068；3.武漢一元堂生物科技股份有限公司，武漢 430223)

阿魏酸(ferulic acid)，簡稱FA，其化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，是一種酚酸，它常存在于植物細胞壁中，如當歸、川穹、蒲公英、小麥麩皮、玉米皮等，與木質素、多糖交聯形成復雜化合物，其具有良好的耐熱、耐酸性，對光敏感，見光易分解轉化為其他物質。阿魏酸具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、降血脂、防治冠心病、抑菌消炎、預防癌癥和抗突變等多種作用[1-8]。劉麗萍[9]采用1%的氫氧化鈉溶液分別提取了玉米面和玉米皮中的阿魏酸，并用HPLC進行了分離測定，發現其阿魏酸含量分別約為1%和4%～5%；歐仕益等[10]采用0.5%的氫氧化鈉溶液能快速使麥麩中大部分阿魏酸游離出來；Faulds C B等[11]選用木聚糖酶和阿魏酸酯酶協同酶解小麥麩皮，發現可以有效打破細胞壁多糖結構，顯著提高阿魏酸的提取效率；Hoa T T等[12]選用超聲波輔助堿解法提取谷糠中阿魏酸取得較佳效果；Sun等[13]采用超聲波溶劑法提取了川穹中的阿魏酸，發現以乙醇為溶劑，超聲波提取效率顯著優于堿提法；Grabber J H等[14]采用組織培養獲得了較高含量的阿魏酸衍生物。

老陳醋，是以高粱為主要原料，以谷糠和麩皮為輔料，大曲為糖化發酵劑，經糖化酒精發酵、醋酸發酵，再經熏醅、陳釀等工藝釀造而成的傳統固態食醋，老陳醋工藝也在我國北方其他地方被推廣，而根據地方谷物資源，原料可選用玉米、小米、麩皮、大米等來釀造。對老陳醋中有機酸的研究較多，而很少涉及阿魏酸，弓曉艷[15]以山西老陳醋為研究對象，探究了老陳醋的微生物群落結構動態變化，發現包括乳酸菌、醋酸菌、各種芽孢桿菌等優勢細菌；蘇靜[16]研究了老陳醋中多酚類物質及其抗氧化活性；王元太等[17]研究了老陳醋中除了乙酸和乳酸外α-酮戊二酸、蘋果酸及琥珀酸含量較高，特別是琥珀酸高達0.787 mg/mL，正是由于多種不揮發酸的協同作用才使山西老陳醋的酸味醇厚綿長、柔和可口；劉凱鳳等[18]從老陳醋中分離3種產酸菌，包括巴氏醋桿菌、短乳桿菌、枯草芽孢桿菌，其中枯草芽孢桿菌能產生乙酸和琥珀酸，還產生了乙偶姻和3種吡嗪類物質。

有學者對食醋中阿魏酸的菌種、轉化、功能進行了研究[19-24]，代謝產生阿魏酸的一般為煙曲霉、黑曲霉。實驗在納豆發酵過程中發現納豆枯草芽孢桿菌具有代謝產生阿魏酸的酶系，因此將其用于老陳醋中，研究其對老陳醋原料玉米、麩皮和谷糠等的酶解作用，以期提升老陳醋中阿魏酸的含量，為工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米、麩皮、谷糠、大曲、特級老陳醋：由湖北建始天龍實業有限公司提供。

氯化鈉、蛋白胨、酵母膏、無水乙醇、乙酸乙酯、氫氧化鈉、乙酸：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

納豆枯草芽孢桿菌(菌種編號：WBUSPN02)：實驗室保藏菌種。

液體培養基：1% NaCl、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、100 mL去離子水，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器設備

PC-420磁力恒溫攪拌器 美國Corning公司；HRN32手持折射儀 德國托摩根公司；SW-CJ-2D凈化工作臺 廣州瑞智科學儀器有限公司；LHS-250SC型智能恒溫恒濕箱 上海浦東榮豐科學儀器有限公司；SLY-2112B型大型立式雙層大容量恒溫培養搖床 金壇市盛藍儀器制造有限公司；YM系列A型立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫療器械有限公司；QDWZⅠ3000-7D濕法粉碎機 無錫輕大食品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 老陳醋工藝流程

1.3.2 操作要點

取5 kg玉米，粉碎至通過100目篩的質量比為1∶1；取3.2 kg大曲，粉碎至能通過200目篩。

潤水蒸熟后的高粱，混合大曲，攪拌均勻，入缸，20 ℃保溫4 h，進入糖化和酒精發酵，每天攪拌1次，發酵5 d至酒精度不再上升，封缸發酵10 d。

取谷殼12 kg谷糠和6 kg麩皮，與上述制備的酒醪混合均勻，敞口放置6 h，接種0.5 kg醋化醅，開始醋酸發酵，每天翻拌1次，至第8天時總酸不再升高，加食鹽封醅。

1.3.3 不同發酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸含量的影響

在老陳醋糖化和酒精發酵、封缸發酵、醋酸發酵過程中都有微生物的作用，利用微生物代謝酶系和自身代謝機制，將原料的各種成分代謝為葡萄糖、乙醇、乙酸、乳酸等營養風味物質，包括阿魏酸的代謝形成。分別在糖化酒精發酵階段的第1天、第3天，封缸發酵的第1天、第4天，醋酸發酵的第1，3，5，7天時加入玉米和大曲總質量6.0%的納豆枯草芽孢桿菌，取醋酸發酵結束時，測定醋醅的阿魏酸和總酸含量，以不接種納豆枯草芽孢桿菌作對照，每組做3個平行實驗。

1.3.4 菌種不同接種量對阿魏酸含量的影響

在傳統老陳醋釀造過程中分離得到多種芽孢桿菌，而這些芽孢菌是食醋風味形成的重要菌群，接種強化菌劑可能會對老陳醋發酵菌群產生影響，自然會影響阿魏酸的代謝。根據1.3.3中阿魏酸含量的結果確定接種時間，納豆枯草芽孢桿菌接種量分別設置為0.0%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0%和8.0%，醋酸發酵結束時，測定醋醅的阿魏酸和總酸含量，每組做3個平行實驗。

1.3.5 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

取玉米50 g，粉碎至通過200目篩，加水200 g，115 ℃滅菌20 min，接種玉米漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液，置于轉速100 r/min、36 ℃的搖床上發酵培養72 h，分別取發酵0，6，12，18，24，30，36 h的發酵液，測定阿魏酸的含量，做4個平行實驗。

1.3.6 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

取麩皮50 g，粉碎至通過200目篩，加水200 g，115 ℃滅菌20 min，接種麩皮漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液，置于轉速100 r/min、36 ℃的搖床上發酵培養72 h，分別取發酵0，6，12，18，24，30，36 h的發酵液，測定阿魏酸的含量，做4個平行實驗。

1.3.7 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

取谷糠50 g，粉碎至通過200目篩，加水200 g，115 ℃滅菌20 min，接種谷糠漿液6.0%(V/m)的納豆枯草芽孢桿菌種子液，置于轉速100 r/min、36 ℃的搖床上發酵培養72 h，分別取發酵0，6，12，18，24，30，36 h的發酵液，測定阿魏酸的含量，做4個平行實驗。

1.3.8 食醋質量評價

以1.3.4研究的納豆枯草芽孢桿菌種子液添加時間和添加量按照1.3.1的老陳醋工藝流程制備老陳醋，測定總酸、不揮發酸、可溶性無鹽固形物和阿魏酸等理化指標，以不添加納豆枯草芽孢桿菌制備的老陳醋為對照，對老陳醋進行質量評價。

1.4 指標測定

1.4.1 阿魏酸的測定

參照何粉霞[25]關于阿魏酸的測定方法，并做適當優化。取醋醅，壓榨取醋汁，或發酵漿液過濾后，5000 r/min離心，取上清液10 mL，加入6 mL乙酸乙酯萃取，重復3次，取乙酸乙酯層，合并萃取液，旋轉蒸干，得到阿魏酸粗品。用4 mL無水乙醇溶解，于286 nm下測定其吸收值，每個樣品做3個平行實驗。

1.4.2 總酸、不揮發酸、可溶性無鹽固形物的測定

參考GB 18187-2000《釀造食醋》中規定的方法測定。

2 結果與分析

2.1 不同發酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸含量的影響

食醋是一種通過多菌系相互拮抗、多階段的復雜發酵過程獲得的傳統發酵調味品，其原料涉及到多種谷物及其加工副產物，營養成分豐富而復雜，基于研究阿魏酸的變化，添加微生物強化菌劑，同時也可能會影響食醋發酵進程，進而影響食醋的感官和理化指標。由于食醋在糖化酒精發酵、封缸發酵、醋酸發酵中都有微生物的代謝活動，因此選擇在這些發酵過程中添加納豆菌，研究其對食醋的影響，見圖1。

圖1 不同發酵階段添加納豆枯草芽孢桿菌對醋汁阿魏酸和總酸含量的影響Fig.1 Effect of inoculating Bacillus subtilis natto in different fermentation stages on ferulic acid and total acid content of vinegar juice

由圖1可知，在糖化酒精發酵起始或初期加入納豆枯草芽孢桿菌，醋汁的阿魏酸含量分別達到了60.16，59.28 mg/L，在醋酸發酵階段加入，則對阿魏酸含量的提升不如糖化階段顯著，僅為36.59 mg/L，且添加時間越晚，阿魏酸含量越小，但比在封缸發酵階段添加效果仍明顯好。在糖化和醋酸發酵起始時添加，會顯著降低醋汁的總酸含量，使總酸下降約1.2 g/dL，嚴重影響原料利用率，可能是此時添加會影響其他微生物增殖，進而影響食醋發酵進程，因此選擇在糖化酒精發酵第3天添加納豆枯草芽孢桿菌較適宜。

2.2 菌種不同接種量對阿魏酸含量影響

食醋發酵過程是一個霉菌、酵母、細菌等幾十種甚至上百種菌株受營養成分和生長條件影響，而此消彼長、相互影響的復雜發酵體系，而納豆枯草芽孢桿菌是一種好氧菌，繁殖和適應環境能力強，添加至發酵中的菌落數可能會競爭抑制其他菌落的增殖與代謝。

由圖2可知，在糖化酒精發酵第3天添加納豆枯草芽孢桿菌，隨著接種量的增大，阿魏酸含量先快速上升至59.36 mg/L，而后增長緩慢趨于穩定，而總酸隨著接種量的增大較穩定，但增至5.0%以后顯著下降，可能是接種量過大打破了糖化酒精發酵過程的菌群平衡，影響了發酵進程，降低了原料利用率，因此接種量為5.0%時較合適。

圖2 納豆枯草芽孢桿菌不同接種量對醋汁阿魏酸和總酸含量的影響Fig.2 Effect of different inoculation amount of Bacillus subtilis natto on ferulic acid and total acid content in vinegar juice

2.3 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

玉米作為三大主糧之一，也是釀造食醋的主要原料，劉麗萍以玉米研究對象，探究了玉米中阿魏酸的含量，通過加強堿水解，發現玉米面中含有較高含量的阿魏酸，而玉米麩皮中含量更高，可達5%。

由圖3可知，將玉米粉碎，高溫蒸煮后接種納豆枯草芽孢桿菌，阿魏酸隨著發酵時間的延長先緩慢增加后顯著增加，至24 h時達到3.729 g/L，而后緩慢減小。接種后，菌株快速增殖，代謝分泌酶系酶解玉米營養成分，產生阿魏酸，當阿魏酸增至最高時，可能菌株又分泌酶解阿魏酸的酶，使之又緩慢減少。

圖3 玉米接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響Fig.3 Effect of maize inoculated with Bacillus subtilis natto on ferulic acid content

2.4 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

麩皮是固態食醋釀造中一種重要的輔料，也是制作大曲的原料，同時其含有較高的淀粉、蛋白質、纖維素等營養成分，也被微生物利用，張欣等綜述了含有阿魏酸的主要原料，包括麩皮、玉米、谷殼等。

由圖4可知，發酵麩皮漿液的阿魏酸含量與玉米漿液變化趨勢一致，但發酵至24 h時，阿魏酸含量僅為1.018 g/L，為玉米漿液的27.29%,顯著低于玉米漿液的含量，由于玉米和麩皮的粒徑一樣小，因此，可以推測麩皮的阿魏酸含量遠低于玉米。

圖4 麩皮接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

2.5 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

谷糠也是固態食醋釀造的重要輔料，其起著疏松醋醅、供給氧氣、利于物質和熱量交換的作用，對食醋醋酸發酵成敗至關重要。谷糠與玉米、麩皮在質地和營養成分上的較大的區別，其主要成分為纖維素、半纖維素和木質素，在醋酸發酵時其不高溫蒸煮，且整粒使用不粉碎。

圖5對比了整粒和粉碎谷糠漿液發酵過程中阿魏酸含量的變化，其中粉碎谷糠漿液的阿魏酸變化趨勢與玉米、麩皮漿液一致，發酵24 h時阿魏酸含量最高，達到0.661 g/L，僅為玉米漿液的17.72%，而不粉碎的谷糠在發酵6 h后才檢測到且增長緩慢，至36 h時其含量為0.087 g/L，僅為粉碎谷糠發酵24 h的13.16%。對比接種納豆枯草芽孢桿菌對玉米、麩皮和谷糠中阿魏酸含量的影響，由于醋酸發酵時谷糠不蒸煮、不粉碎，因此，醋汁中阿魏酸的含量主要來源于納豆枯草芽孢桿菌對玉米、麩皮的酶解產生。

圖5 谷糠接種納豆枯草芽孢桿菌對阿魏酸的影響

2.6 老陳醋質量評價

以玉米為原料，采用老陳醋傳統釀造工藝，在糖化酒精發酵第3天添加玉米和大曲總質量5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液，釀造老陳醋，黑褐色、體態黏稠、酯香濃郁，總酸為6.16 g/dL，阿魏酸含量為32.45 mg/L，實驗制備的老陳醋與不添加納豆枯草芽孢桿菌釀造的老陳醋、以高粱為原料釀造的特級老陳醋相比，理化指標見表1。

表1 老陳醋理化指標Table 1 The physicochemical indexes of aged vinegar

由表1可知，總酸、不揮發酸、可溶性無鹽固形物差異不顯著，而添加種子液，阿魏酸含量是對照組的3.7倍，是高粱特級老陳醋的近10倍。添加納豆枯草芽孢桿菌種子液作為強化菌劑，在不影響老陳醋整體品質的基礎上，提高了以玉米為原料的老陳醋阿魏酸的含量，提升了老陳醋功能性，同時提高了原料利用率和產品附加值。

3 結論

將納豆發酵用菌種納豆枯草芽孢桿菌用于提高老陳醋中阿魏酸含量。通過實驗，發現在糖化酒精發酵開始的第3天添加5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液，醋酸發酵結束時醋汁中阿魏酸含量高達59.36 mg/L。而在糖化酒精發酵第1天添加，雖然阿魏酸含量更高，但會競爭性抑制原有菌群的增殖和代謝，使總酸含量顯著降低，進而影響原料的轉化率；封缸發酵時添加，阿魏酸含量增加不顯著，可能是此時封缸發酵為厭氧發酵，納豆枯草芽孢桿菌不增殖，或菌體直接自溶，在后期醋酸發酵菌落數也較少，效果不佳；醋酸發酵起始時添加，阿魏酸可達36.59 mg/L，添加時間越晚，其含量越小，可能是納豆枯草芽孢桿菌受到醋酸菌的競爭抑制和高濃度醋酸的脅迫，影響其增殖與代謝。

食醋中的3種原輔料玉米、麩皮和谷糠經粉碎、打漿、115 ℃滅菌后，分別接種納豆枯草芽孢桿菌，隨著發酵時間的延長，阿魏酸含量均是先顯著增大而后緩慢減小，均在24 h時達到最大值，分別為3.729，1.018，0.661 g/L，因此，納豆枯草芽孢桿菌可能是代謝相關酶系降解原料中的阿魏酸酯生成阿魏酸，當阿魏酸酯含量極低時，菌株代謝酶解阿魏酸的酶系，使阿魏酸進一步酶解而含量緩慢減小。谷糠不粉碎時，阿魏酸緩慢增加，至36 h時其含量為0.087 g/L，僅為粉碎谷糠發酵24 h的13.16%，由于食醋釀造時，谷殼不粉碎、不高溫加熱，因此醋汁中阿魏酸主要來源于玉米和麩皮。

以玉米為原料，采用老陳醋傳統釀造工藝，在糖化酒精發酵第3天添加玉米和大曲總質量5.0%的納豆枯草芽孢桿菌種子液，釀造的老陳醋，酯香濃郁，總酸為6.16 g/dL，阿魏酸含量為32.45 mg/L，其阿魏酸含量是不添加種子液的3.7倍、高粱特級老陳醋的近10倍，添加納豆枯草芽孢桿菌種子液作為強化菌劑，在不影響老陳醋整體品質的基礎上，提高了以玉米為原料的老陳醋的阿魏酸含量，提升了老陳醋的功能性，為工業化生產提供了理論基礎。