長鏈非編碼RNA HHIP-AS1調節MAPK信號活性抑制非小細胞肺癌增殖、遷移和侵襲

張平弟 吳永豐

肺癌是導致癌癥死亡的主要原因[1]。非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌主要亞型，病人5年生存率不足20%，迫切需要探索NSCLC進展的分子機制[2-4]。許多長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在包括肺癌等癌癥中異常表達，發揮癌基因或抑癌作用[5-6]。HHIP反義RNA 1(hedgehog-interacting protein antisense RNA 1，HHIP-AS1)是最新鑒別的lncRNA分子，Bo等[7]研究發現，HHIP-AS1在肝癌組織中表達異常下調，通過與huR/HHIP相互作用抑制肝細胞癌惡性進展。有學者在整合分析肺腺癌差異表達基因譜發現HHIP-AS1表達明顯缺失[8]。本研究探究HHIP-AS1對肺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及潛在調控機制。

對象與方法

一、對象

我院2019年1月～2020年6月胸外科收治的NSCLC病人癌組織和對應癌旁組織(距離病灶>3 cm)40例。男性24例，女性16例；年齡32～73歲，中位年齡57歲；鱗癌15例，腺癌20例，腺鱗癌5例。均未進行包括放療、化療以及其他任何輔助性腫瘤治療。均簽署知情同意書。本試驗經我院倫理委員會批準。

二、方法

1.試驗細胞：肺上皮細胞BEAS-2B和NSCLC細胞株A549、H1975、HCC827、H1299(中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所)。

2.主要試劑與材料：pcDNA3.1-HHIP-AS1、陰性對照NC(上海吉碼生物科技有限公司)；轉染試劑脂質體Lipofectamine?3000(Thermo Fisher公司，美國)；熒光定量試劑盒One Step SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit(大連寶生物有限公司)；兔源一抗GAPDH、p-MEK1/2、p-p38和MMP-2以及HRP標記的二抗(武漢三鷹生物技術有限公司)；CCK-8檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司)。

3.細胞培養及處理：細胞加入10%胎牛血清及100 U/ml青霉素-鏈霉素的培養基37 ℃，5% CO2培養箱培養。細胞長至90%用0.25%胰蛋白酶消化傳代。以1×105/孔的密度接種細胞于6孔板，長至50%～60%更換成無血清培養基。轉染pcDNA3.1-HHIP-AS1和pcDNA3.1-NC至H1299細胞，實驗分組為：空白對照組(不進行轉染處理)、陰性對照組(轉染pcDNA3.1-NC)、HHIP-AS1過表達組(轉染pcDNA3.1-HHIP-AS1)。

4.CCK-8實驗：以1×104/孔的密度接種細胞至96孔板，長至50%轉染處理。轉染后0小時、24小時、48小時、72小時，每孔加入5 μl的CCK-8溶液，繼續培養4小時加入DMSO終止反應，酶標儀在490 nm的波長下測定吸光度值，以空白為對照檢測細胞增殖情況。

5.劃痕實驗：細胞長滿呈單層用Tip槍頭垂直孔板劃線，形成無細胞生長區域，洗去脫落細胞，記錄劃痕區拍照；處理24 小時后洗去劃落細胞，倒置顯微鏡拍照，分析細胞從致傷區遷移的相對距離。

6.trans-well實驗：取基質膠稀釋液100 μl涂于trans-well小室底部基底膜，4 ℃風干后加100 μl培養基水化基底膜，37 ℃靜置1小時，重懸細胞至濃度1×105/ml；棄去小室液體，加入含10%血清培養液900 μl，接種約1×105細胞，常規培養24小時；取出小室洗滌，4%多聚甲醛固定30分鐘；待膜風干晶紫染液染色20分鐘，反復淋洗，光學顯微鏡拍照，每組隨機選取3個視野計數。

7.RT-qPCR檢測：細胞處理48小時后加入800 μl Trizol試劑提取細胞總RNA。反轉錄合成cDNA，進行定量PCR檢測，目標基因的表達使用GAPDH作為內參，定量結果采用2-ΔΔCt表示。引物序列見表1所示。

表1 引物序列

8.Western blotting檢測：細胞轉染48小時后加入200 μl蛋白裂解液提取總蛋白。加入SDS上樣緩沖液，沸水煮10分鐘蛋白質變性。電泳，轉膜，封閉，孵育一抗(1∶1 000)過夜，TBST洗膜，孵育二抗(1∶5 000)1小時，TBST洗膜，避光環境顯影曝光并拍照。最終結果表示為目標條帶與內參GAPDH的光密度比值。

三、統計學分析

結果

1.HHIP-AS1在NSCLC組織中表達：癌旁組織HHIP-AS1表達量為(1.000±0.057)，腺癌組織表達量為(0.573±0.0820.01)，鱗狀細胞癌組織表達量為(0.603±0.079)，腺鱗癌組織表達量為(0.592±0.039)，與癌旁組織中HHIP-AS1的表達水平比較明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.HHIP-AS1在NSCLC細胞中表達：與BEAS-2B相比(1.000±0.049)，NSCLC細胞A549(0.763±0.049，P<0.01)、H1975(0.675±0.045，P<0.01)、HCC827(0.619±0.056，P<0.01)和H1299(0.433±0.032，P<0.01)中HHIP-AS1的表達水平異常降低。

3.過表達HHIP-AS1轉染效率：HHIP-AS1的表達水平空白對照組(1.000±0.074)和陰性對照組(1.032±0.050)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；HHIP-AS1的表達水平在HHIP-AS1過表達組(14.774±0.857)明顯高于陰性對照組(P<0.01)。說明過表達HHIP-AS1轉染效果明顯。

4.過表達HHIP-AS1對NSCLC細胞增殖的影響見圖1：H1299細胞活力在空白對照組和陰性對照組中差異無統計學意義(P>0.05)；而HHIP-AS1過表達組(14.774±0.857)H1299細胞活力明顯低于陰性對照組(48小時，P<0.05；72小時，P<0.01)。說明過表達HHIP-AS1抑制了肺癌細胞H1299的增殖活力。

圖1 過表達HHIP-AS1對H1299細胞增殖活力的影響

5.過表達HHIP-AS1對NSCLC細胞遷移的影響見圖2：H1299細胞傷口愈合率空白對照組(52.857±1.929)和陰性對照組(49.003±1.951)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而HHIP-AS1過表達組(17.293±1.477)H1299細胞傷口愈合率明顯低于陰性對照組(P<0.01)。說明過表達HHIP-AS1抑制了肺癌細胞H1299的遷移能力。

圖2 過表達HHIP-AS1對H1299細胞遷移的影響(結晶紫染色×100)

6.過表達HHIP-AS1對NSCLC細胞侵襲的影響見圖3：H1299細胞侵襲數量空白對照組(169.333±7.219)和陰性對照組(158.000±5.508)比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而HHIP-AS1過表達組(86.000±6.429)H1299細胞侵襲數量明顯少于陰性對照組(P<0.01)。說明過表達HHIP-AS1抑制了肺癌細胞H1299的侵襲能力。

圖3 過表達HHIP-AS1對H1299細胞侵襲的影響(結晶紫染色×100)

7.過表達HHIP-AS1對NSCLC細胞MAPK信號通路活性的影響見圖4：p-MEK1/2、p-p38和MMP-2的表達水平，空白對照組和陰性對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；而HHIP-AS1過表達組H1299細胞中p-MEK1/2(P<0.01)、p-p38(P<0.01)和MMP-2(P<0.01)表達水平較陰性對照組明顯降低。說明過表達HHIP-AS1抑制了MAPK信號通路活性。

圖4 過表達HHIP-AS1對H1299細胞p-MEK1/2、p-p38和MMP-2表達的影響

討論

LncRNA通過在多項細胞生理和病理過程中發揮作用參與肺癌進展，包括增殖，凋亡，分化，遷移和侵襲等[9-10]。目前，在肺癌中已經鑒別出許多失調的lncRNAs[11-13]。如BRCAT54通過與RPS9結合轉錄調控JAK-STAT和鈣離子信號通道相關基因抑制NSCLC的增殖和遷移[11]。FER1L4在肺癌病人血液、組織以及肺癌細胞株中表達下調，能夠促進PTEN和p53表達、抑制AKT磷酸化，增加NSCLC細胞凋亡比例、抑制細胞增殖[12]。SOX2-OT與肺癌病人不良臨床預后和惡性表型相關，影響厄洛替尼和順鉑敏感性，阻礙肺癌治療[13]。HHIP-AS1作為一種新型腫瘤相關lncRNA，已經被發現在肝細胞癌、甲狀腺癌中表達異常[7,14-15]，在肺癌中的表達與生物學功能還有待研究。

我們收集40例NSCLC病人手術切除的癌組織樣本以及對應癌旁組織樣本，RT-qPCR檢測發現，HHIP-AS1在肺腺癌、鱗狀細胞癌和腺鱗癌組織中表達均低于對應癌旁組織；同時發現，HHIP-AS1在不同NSCLC細胞株中表達均明顯低于正常肺上皮細胞BEAS-2B。以上結果與Jin等[8]測序發現HHIP-AS1在肺癌中異常低表達結果吻合，提示HHIP-AS1可能參與肺癌發展。我們通過體外瞬時轉染HHIP-AS1的過表達質粒，增強其在NSCLC細胞H1299中表達，觀測其表達增加對NSCLC細胞H1299增殖、遷移和侵襲過程的影響。結果發現，增強HHIP-AS1表達明顯抑制了H1299細胞增殖活力，同時降低了細胞的遷移和侵襲能力。HHIP-AS1作為腫瘤相關lncRNA新分子，其在腫瘤發展過程中分子功能尚不清楚。有研究表明，HHIP-AS1在肝癌中表達缺失，并能夠作為抑癌因子可能在肝細胞癌的治療中發揮積極作用[7]。本研究發現，HHIP-AS1能夠減弱NSCLC細胞增殖和轉移的發生，緩解細胞的惡性表型。

為探討HHIP-AS1調控NSCLC細胞增殖和轉移的可能分子機制，在H1299細胞中上調HHIP-AS1表達后我們檢測了MAPK信號通路相關蛋白p-MEK1/2、p-p38和下游效應因子MMP-2的表達情況，結果發現，增強HHIP-AS1表達p-MEK1/2、p-p38和MMP-2的表達均減少，說明HHIP-AS1抑制了MAPK信號活性。MAPK是一組能夠被多種信號激活的絲氨酸/蘇氨酸激酶。MAPK信號轉導通路在真核細胞中廣泛介導細胞反應，參與細胞增殖、分化、轉化、應激反應和其他生物反應[16-17]。MAPK信號通路是細胞外刺激和細胞內基因表達之間的橋梁，在腫瘤發展中起重要作用，在肺癌中被異常激活[18-19]。p38 MAPK蛋白參與PTPL1/TGF-β1軸調控肺癌細胞遷移[20]。此外，lncRNA SDPR-AS能夠靶向SDPR通過p38/MAPK/ERK通路抑制非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲[21]。我們的研究結果能夠推斷在肺癌中表達異常缺失的HHIP-AS1可能影響p38/MAPK/MEK通路轉導活性，促進肺癌細胞增殖、遷移和侵襲，加速其惡性發展。

HHIP-AS1在肺癌組織和細胞中異常低表達，增強HHIP-AS1表達抑制肺癌細胞增殖、遷移和侵襲，其作用機制可能與MAPK通路活化受到抑制有關。本研究發現有助于加深了解HHIP-AS1在肺癌進展中生物學作用，但是HHIP-AS1如何直接作用MAPK通路的具體機制仍需進一步探究。