秀珍菇多酚提取工藝優化及抗氧化活性探究

楊斌，宋厚輯，鄭峻，夏俊慧，李佳歡,2，蘭世步，孫淑靜,2，胡開輝,2*，金文松,2*

(1.福建農林大學 生命科學學院，福州 350002；2.福建農林大學(古田)菌業研究院，福建 寧德 352200；3.福建省食用菌技術推廣總站，福州 350003；4.羅源縣食用菌研發中心，福州 350600)

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)，又名小平菇，傘菌目、側耳科、側耳屬大型真菌。秀珍菇子實體味道鮮美、營養豐富，有“菇中極品”的美稱[1]。此外相關研究表明，秀珍菇子實體多糖具有抗氧化[2-3]、抗炎癥[4]、抗腫瘤[5]、抗衰老[6]等多種生物功能，在食品、保健、醫藥等領域具有較高的應用價值。

多酚是植物和大型真菌生長發育過程中一類重要的次生代謝產物，因其具有多個酚羥基結構，可快速捕捉周圍環境中的自由電子，具有強抗氧化性，是一類天然的抗氧化劑[7-8]，在醫藥領域具有重要的應用價值。此外，多酚類物質還具有抑菌活性，可運用于食品保鮮和防腐，擁有開發成天然防腐劑的潛力[9-11]，因而受到了研究人員的廣泛關注。目前關于真姬菇[12-13]、香菇[14]、牛肝菌[15-16]等常見食用菌多酚提取工藝和生物活性的研究已有報道，但是關于秀珍菇多酚的功能研究國內外還鮮見報道，這在一定程度上限制了秀珍菇功能性保健食品和調味品的開發和應用。因而，本研究選擇秀珍菇干品作為實驗材料，采用超聲輔助水提法對秀珍菇多酚進行提取，并對提取工藝進行優化，此外，還對秀珍菇多酚的體外抗氧化活性和自由基清除能力進行探究，以期為提升秀珍菇的綜合利用價值奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秀珍菇干品：購于福建省古田縣食用菌市場；無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、十二水合磷酸鈉、福林酚、碳酸鈉、鉬酸銨：均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；1-1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、維生素C：均購于美國Sigma公司；沒食子酸：購于上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設備

FS1000Y-1不銹鋼高速粉碎機 廣州雷邁機械設備有限公司；BILON22-500D超聲波清洗機 上海比朗儀器制備有限公司；QL-866型旋渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；3020型多功能酶標儀 賽默飛世爾科技有限公司；3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；DK-8B型電熱恒溫水浴槽 上海精宏實驗設備有限公司；FA2004B型電子天平、UV765型紫外可見光分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 原材料預處理

應用粉碎機將秀珍菇干品粉碎，過60目篩，制成樣品備用。

1.3.2 多酚含量測定

參照張梅梅等[17]的測定方法，以沒食子酸質量濃度為橫坐標，以對應的吸光值為縱坐標，繪制標準曲線(見圖1)，所得線性方程為y=10.088x+0.0261，R2=0.9981。在750 nm處分別測定各實驗條件制備的多酚水溶液吸光值，按照式(1)計算多酚得率。

圖1 多酚含量測定標準曲線Fig.1 The standard curve for determination of polyphenols

(1)

式中：C為標準曲線計算所得的多酚濃度(mg/mL)； V為提取液總體積(mL)；m為干粉質量(g)；D為稀釋倍數。

1.3.3 秀珍菇多酚提取單因素實驗

稱取秀珍菇粉末1 g，以水作為提取溶劑，單因素設計分析溫度(35，40，45，50，55，60 ℃)、時間(30，60，90，120，150 min)、超聲功率(200，250，300，350，400 W)、液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1，mL/g)對秀珍菇多酚提取得率的影響。

1.3.4 響應面工藝優化

基于單因素實驗結果，分別選擇4個因素(溫度、時間、功率、液料比)適合進一步優化的區域值，設計因素水平編碼(見表1)，以多酚得率為響應值，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計29組實驗，對秀珍菇多酚提取工藝進行優化。

表1 Box-Behnken設計因素水平編碼Table 1 The factors and levels of Box-Behnken design

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 總抗氧化能力測定

參考梁引庫等[18]的測定方法，待反應結束后，取200 μL的反應液置于96孔板中，于695 nm處測量吸光度，以去離子水作空白對照，維生素C作陽性對照，每個濃度設3個平行，取平均值。

1.3.5.2 DPPH自由基清除能力測定

參考Ma等[19]的測定方法，待反應結束后，取200 μL反應液至96孔板中，于515 nm處測得樣品吸光度(As)，以水作空白對照測得空白吸光度(Ac)，用無水乙醇代替DPPH溶液測得樣品本底吸光度(Aj)，每個濃度設3個平行，用維生素C作陽性對照，按照式(2)計算DPPH自由基清除率。

(2)

1.3.5.3 ABTS自由基清除能力測定

參考Re等[20]的測定方法，待反應結束后，取200 μL反應液至96孔板中，于734 nm處測得樣品吸光度(As)，以水代替樣品作為空白對照測得空白吸光度(Ac)，以無水乙醇代替ABTS工作液測得樣品本底吸光度(Aj)，每個濃度設3個平行，以維生素C作為陽性對照，按照式(3)計算ABTS自由基清除率。

(3)

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同溶劑對多酚得率的影響

在本實驗中，首先探究提取溶劑是否會對多酚得率產生影響。由圖2可知，以水作為提取溶劑，多酚得率最高，隨著溶劑極性的減小，多酚得率逐漸降低，表明秀珍菇多酚極性較大，易溶于水，因而后續實驗選擇以水作為提取溶劑。

圖2 溶劑對多酚得率的影響Fig.2 Effects of the solvents on the yield of polyphenols

2.1.2 不同提取溫度對多酚得率的影響

以水作為提取溶劑的基礎上，本研究進一步分析溫度對多酚提取得率的影響，實驗結果見圖3。

由圖3可知，在30～55 ℃溫度范圍內，溫度對多酚提取得率的影響不大，但在45 ℃時，多酚得率達到最大值(7.52 mg/g)，可能在該溫度范圍內易使細胞壁軟化，改變細胞膜的通透性，促進胞內物質溶出。但溫度達到60 ℃時，多酚得率明顯下降，可能是因為多酚類物質屬于熱敏物質，溫度過高會導致酚類物質被分解，從而降低多酚的提取得率。因此，秀珍菇多酚的最適提取溫度為45 ℃。

圖3 提取溫度對多酚得率的影響Fig.3 Effects of the extraction temperature on the yield of polyphenols

2.1.3 不同提取時間對多酚得率的影響

本研究系統地分析了30～150 min的處理時間對秀珍菇多酚提取效果的影響，見圖4。

圖4 提取時間對多酚得率的影響Fig.4 Effects of the extraction time on the yield of polyphenols

由圖4可知，當提取時間為90 min時，多酚得率達到最大值(8.2 mg/g)。實驗結果表明測定的多酚含量取決于提取時間，當胞內多酚逐漸溶出直至胞外濃度趨于飽和時，得率逐漸上升；由于多酚在高溫下的不穩定性，多酚可能以一定的速率進行降解，當多酚溶出速率與降解速率持平時，即可獲得理論上的最大多酚得率。本組單因素實驗結果表明最適提取時間為90 min。

2.1.4 不同超聲功率對多酚得率的影響

超聲波是一種彈性波，其振動可以產生巨大的能量，在提取過程中加以超聲處理可以加速細胞壁的破裂，促進胞內物質溶出，可有效提高提取的效率。

由圖5可知，多酚得率隨著超聲功率的增加整體呈先上升后下降的趨勢，當超聲功率為300 W時，多酚得率達到最大值(6.45 mg/g)；進一步加大超聲功率，多酚得率大幅下降，推測原因可能為大額功率超聲時產生大量熱量，破壞了多酚結構。

圖5 超聲功率對多酚得率的影響Fig.5 Effects of the ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.5 不同液料比對多酚得率的影響

不同液料比對多酚得率的影響見圖6。

圖6 液料比對多酚得率的影響Fig.6 Effects of liquid-solid ratio on the yield of polyphenols

由圖6可知，液料比在20∶1～70∶1(mL/g)范圍內時，多酚得率隨著液料比的增加而逐漸增加，當液料比為70∶1(mL/g)時，多酚得率最高，繼續增加液料比，多酚得率緩慢下降。實驗結果表明樣品量不變時，增加提取溶劑的體積，多酚得率增加，究其原因可能為樣品與溶劑接觸的表面積增大；繼續增加液料比，胞內胞外多酚濃度逐漸趨于一致，此時多酚得率逐漸趨于穩定或略有下降。

2.2 響應面實驗法優化提取工藝條件

2.2.1 回歸方程建立

根據單因素實驗結果，以溫度、時間、超聲功率和液料比為自變量，多酚得率為因變量，對超聲水提秀珍菇的工藝進行優化，Box-Behnken設計與結果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對所得數據進行分析和擬合，得到二次回歸方程：

表2 Box-Behnken設計及實驗結果

Y=17.32-0.51A-0.48B-0.46C-0.37D-0.48AB+0.53AC+0.91AD+0.44BC-1.05BD+0.39CD-1.49A2-1.03B2-2.18C2-1.28D2。

2.2.2 模型方差分析

模型方差分析結果見表3，模型的F值=24.2，(Prob>F)<0.0001，表明所構建的模型極顯著，實驗設計合理且具有統計學意義；失擬項的(Prob>F)>0.05，不顯著，相關系數R2=0.963，RAdj2=0.9232，表明所建模型可用于預測秀珍菇水提多酚的實際得率，預測值與實驗值的擬合程度高，92.32%的秀珍菇多酚得率可用此模型來預測；而變異系數C.V.(%)值僅為2.87，表明在實驗過程中精確度高，實驗結果可靠。

表3 回歸方程方差分析結果Table 3 The variance analysis results of regression equations

2.2.3 多酚提取響應面分析

由表3可知，溫度與功率兩因素間的交互作用對多酚提取得率的影響達到顯著水平(P<0.05)，液料比與溫度、時間兩因素間的交互作用均達到極顯著水平(P<0.01)。為較為直觀地觀察因素變化對多酚提取得率變化的影響，根據2.2.1所擬合出的回歸方程，利用Design Expert 8.0.6軟件繪制出的3D曲面圖見圖7～圖9。

功率275～300 W、時間66～90 min時，多酚得率較高(見圖7中a)。功率275～300 W、溫度42～46 ℃時，多酚得率較高(見圖7中b)。液料比60～70(mL/g)、功率275～300 W時，多酚得率較高(見圖8中a)。液料比65～75(mL/g)、時間84～102 min時，多酚得率較高(見圖8中b)。液料比60～70(mL/g)、溫度40～46 ℃時，多酚得率較高(見圖9中a)。時間78～102 min、42～46 ℃時，多酚得率較高(見圖9中b)。分析等高線圖可知，所有的圖形均呈現橢圓形(見圖7～圖9)，表明分析因素間的交互作用對多酚提取具有一定的影響，其中溫度與液料比間的交互作用對多酚提取得率的影響最大，見圖9中a。

圖7 功率和時間(a)、功率和溫度(b)之間的交互作用對多酚得率的影響Fig.7 Effects of the interaction between power and time (a), power and temperature (b) on the yield of polyphenols

圖8 液料比和功率(a)、液料比和時間(b)之間的交互作用對多酚得率的影響Fig.8 Effects of the interaction between liquid-solid ratio and power (a), liquid-solid ratio and time (b) on the yield of polyphenols

圖9 液料比和溫度(a)、時間和溫度(b)之間的交互作用對多酚得率的影響Fig.9 Effects of the interaction between liquid-solid ratio and temperature (a), time and temperature (b) on the yield of polyphenols

2.2.4 響應面分析最優條件實驗驗證

利用Design-Expert 8.0.6對響應面實驗數據進行分析，得出秀珍菇多酚提取的最佳工藝為：液料比67.83∶1(mL/g)，291.7 W，43.75 ℃，提取86.98 min，多酚理論得率為17.486 mg/g。在此基礎上，結合實驗室的實際條件，將所得工藝稍作調整：液料比68∶1(mL/g)，300 W，45 ℃，提取87 min，多酚實際得率為(17.428±0.121)mg/g，與理論得率較為接近，表明所建模型能較好地對秀珍菇多酚的實際得率進行預測，擬合程度高。

2.3 多酚提取物體外抗氧化活性分析

2.3.1 總抗氧化能力分析

采用鉬酸銨法對秀珍菇多酚進行了總抗氧化能力測定，以維生素C作為陽性對照，實驗結果見圖10。

圖10 多酚提取物(a)和維生素C(b)總抗氧化活性分析Fig.10 The total antioxidant activity analysis of polyphenol extracts (a) and Vc (b)

由圖10可知，在0.04～0.2 mg/mL濃度范圍內，多酚提取物和維生素C的總抗氧化能力與濃度呈現正相關性，根據斷點實驗數據，進行線性方程回歸，并分別計算多酚提取物與對照的EC50值。經計算，秀珍菇多酚提取物的EC50=0.177 mg/mL，維生素C的EC50=0.094 mg/mL，表明秀珍菇多酚提取物的總抗氧化能力弱于陽性對照。

2.3.2 DPPH自由基清除能力分析

應用DPPH自由基清除法對秀珍菇多酚體外自由基清除能力進行了測定，以維生素C作為陽性對照，結果見圖11。

圖11 多酚提取物(a)和維生素C(b)DPPH自由基清除能力分析Fig.11 DPPH radical scavenging capacity analysis of polyphenol extracts (a) and Vc (b)

由圖11可知，在0.04～0.2 mg/mL濃度范圍內，多酚提取物和維生素C的DPPH自由基清除率與濃度呈現出良好的線性關系，根據擬合得出的線性方程分別計算出多酚提取物和維生素C的IC50值，其中多酚提取物的IC50=0.363 mg/mL，維生素C的IC50=0.110 mg/mL，結果表明秀珍菇多酚對DPPH自由基具有一定清除能力，約為陽性對照清除DPPH自由基能力的30%。

2.3.3 ABTS自由基清除能力分析

采用ABTS自由基清除法對秀珍菇多酚體外自由基清除能力進行了測定，以維生素C作為陽性對照，結果見圖12。

圖12 多酚提取物(a)和維生素C(b)對ABTS自由基清除能力分析Fig.12 ABTS radical scavenging capacity analysis of polyphenol extracts (a) and Vc (b)

由圖12可知，在0.004～0.02 mg/mL濃度范圍內，多酚提取物清除ABTS自由基的IC50值達0.008 mg/mL，陽性對照清除ABTS自由基的IC50值達0.005 mg/mL。實驗結果顯示秀珍菇多酚清除ABTS自由基能力約為維生素C清除ABTS自由基能力的62.5%，表明秀珍菇多酚擁有較強的清除ABTS自由基能力。

3 結論

本文應用響應面設計法對超聲水提秀珍菇多酚工藝進行了優化，最優提取工藝為：液料比68∶1(mL/g)，300 W，45 ℃，提取87 min，多酚得率為(17.428±0.121)mg/g；同時對秀珍菇多酚體外抗氧化活性和自由基清除能力進行了測定，結果表明秀珍菇多酚具有較強的抗氧化活性和自由基清除能力。以上研究結果為秀珍菇多酚在食品保鮮行業的應用奠定了一定基礎，同時也為秀珍菇功能食品和調味品的開發應用提供了一定的理論依據。