冷榨法提取南瓜籽蛋白質的工藝研究

張雪，唐建華

(1.吉林工程職業學院，吉林 四平 136001；2.揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127)

1 概述

南瓜營養價值較高，是一種既營養又美味的家常蔬菜[1]。而南瓜籽含有的豐富蛋白質、維生素，使其醫藥功效加倍，具有實際研究價值[2]。在南瓜研發熱潮中，蛋白質是南瓜研發的一個重要熱點[3]。南瓜籽蛋白質含量約為35%，人體吸收率在88%～97%之間，具有良好的平衡能力。南瓜籽富含蛋白質、脂肪、礦物質，營養豐富，也是優良的植物蛋白[4]。有學者研究發現，南瓜籽發芽后，蛋白質更具降血糖效果[5]。

以往使用三氯醋酸-丙酮沉淀法提取南瓜籽蛋白質，低溫下將南瓜籽充分研磨后，加入三氯醋酸和丙酮共溶于離心管內，渦旋振蕩，在20 ℃靜置2 h，離心反復洗滌，沉淀至無色，并進行真空冷凍干燥。該方法容易破壞蛋白質，導致提取結果雜質較多；使用電泳法提取南瓜籽蛋白質，借助多種蛋白酶水解南瓜籽蛋白，并篩選出適用于制備南瓜籽蛋白的抑制肽蛋白酶，結合響應面方法優化提取工藝。使用該方法在電場環境中，容易受到背景顏色的影響，使蛋白質無法全部提取，導致蛋白質提取效率低下。因此，在提取南瓜籽蛋白質時，首先要考慮到蛋白質資源的利用，采用冷榨法可以很好地保存南瓜籽的營養成分，以南瓜籽作為原料，采用冷榨法提取蛋白質，并對蛋白質的功能特性進行分析，為其有效利用提供參考。

2 材料與方法

2.1 主要材料與試劑

南瓜籽仁：廣州雪馨花食品有限公司的白瓜籽；正己烷：淄博協創化工有限公司；冰乙酸：濟南金百禾工貿有限公司；乙醇：山東匯豐生物工程有限公司；丙酮：寧波印川國際貿易有限公司；碘化鉀：上海氏典化工科技發展有限公司；硫代硫酸鈉：武漢拉那白醫藥化工有限公司；乙酸鈉：鄭州潤稼化工產品有限公司，上述試劑均為分析純。

2.2 儀器與設備

GY95-冷榨機 廣州國研機械設備制造有限公司；Alpha Imager HP蛋白凝膠成像系統 上海巴玖實業有限公司；M249300超低溫冰箱 北京海富達科技有限公司；LGJ-10-50系列冷凍干燥機 南京貝帝實驗儀器有限公司；DR3900紫外分光光度計 上海植茂環保科技有限公司。

2.3 試驗方法

2.3.1 南瓜籽蛋白質特點分析

2.3.1.1 蛋白質持水性和持油性

蛋白質的持水性和持油性是南瓜籽蛋白質中重要功能特性之一，當溫度和加熱時間增加時，蛋白質出現的反應見圖1。

圖1 蛋白質持水性和持油性分析Fig.1 Analysis of water and oil holding capacity of proteins

由圖1可知，南瓜籽蛋白質綜合持油能力比持水能力強，且隨著溫度升高，蛋白質的持油能力在100 ℃時達到最高。蛋白質的持水能力在60 ℃時達到最高，出現這種情況的主要原因是溫度升高，使蛋白質變性，產生大量極性側鏈基團，增強了蛋白質的親水性和親油性。

2.3.1.2 蛋白質溶解性

蛋白質與水之間的作用力是由蛋白中肽鍵的偶極-偶極作用而產生的，或離子化的、極性側鏈的同分子作用而產生的，蛋白質的溶解性受到pH值的影響較大，其溶解性見圖2。

圖2 蛋白質溶解性Fig.2 The solubility of protein

由圖2可知，當pH值為4.5時，蛋白質的溶解性最差，該值為蛋白質溶解度最低值，因此，可將該點作為提取蛋白質時酸性沉淀的pH值[6]。

pH值對蛋白質提取率的影響見表1。

表1 pH值對蛋白質提取率的影響Table 1 The effect of pH value on the extraction rate of protein

隨著pH值不斷升高，蛋白質的提取率也在不斷增大(P<0.01)[7]。為了確定最佳pH值，不同pH值下提取蛋白質的各個參數試驗條件見表2。

表2 蛋白質各個參數試驗條件Table 2 The test conditions for each parameter of protein

由表3可知，隨著pH值升高，蛋白質的提取效率也在不斷升高[8]。當pH值為10時，變性蛋白的需求量最大，而提取蛋白的含水量最大，故 pH值以10為最佳[9-10]。

表3 測定結果Table 3 The determination results

2.3.1.3 其他特性

對于南瓜籽蛋白質的其他特性進行研究，以大豆蛋白質為基礎，對比結果見表4。

表4 蛋白質其他特性

由表4可知，南瓜籽蛋白質比大豆蛋白質的吸水性、吸油性低，而其他特性比大豆蛋白質要高。

2.3.2 工藝流程

南瓜籽→溫度低于60 ℃→調制→冷榨→冷榨蛋白質→精濾→冷榨南瓜籽蛋白質。

2.3.3 蛋白質提取效率計算

(1)

式中：m1表示提取的蛋白質質量；m表示南瓜籽中蛋白質質量。

2.4 指標測定

2.4.1 冷榨溫度對工藝的影響

在用冷榨法提取南瓜籽蛋白時，適當的高溫有利于保持蛋白質的可塑性，有利于破壞解脂酶、脂肪氧化酶，也便于蛋白質提取后進行儲存和使用。但在高溫環境下，冷榨工藝也會產生一些副作用，如在冷榨過程中水分大量增加，破壞蛋白質的可塑性，在提高蛋白質雜質含量的同時，其他雜質也在增加，因此，研究的冷榨溫度范圍應選擇45～60 ℃。

工藝反應條件：選擇的冷榨溫度分別為45，50，55，60 ℃，研究冷榨溫度對南瓜籽蛋白質提取效率的影響，見表5。

表5 冷榨溫度對工藝的影響Table 5 The effect of cold pressing temperature on process

由表5可知，隨著冷榨溫度的升高，蛋白質的提取效率也不斷提高，但冷榨溫度的標準要求低于60 ℃時，若溫度過高，會嚴重損害南瓜籽的營養成分，故選用60 ℃為宜。

2.4.2 冷榨水分含量對工藝的影響

隨著冷榨水分含量不斷增加，蛋白質的可塑性也在不斷發生變化。當冷榨水分含量達到某一閾值時，南瓜籽蛋白質的提取效果達到最佳，此時的水分含量即為臨界水分。臨界水分與溫度、蛋白質變性程度有關，在冷榨過程中，主要影響蛋白質提取純度的是含水量，當水分含量過低時，冷榨溫度升高，此時蛋白質變性，影響工藝效果；當水分含量過高時，破壞南瓜籽，無法形成蛋白質，南瓜籽蛋白質的提取效率低，同樣也影響工藝效果。

工藝反應條件：通過表5確定的最佳冷榨控制溫度為60 ℃，在該溫度下，選取水分含量分別為5%、10%、15%、20%進行冷榨，由此研究冷榨水分含量對南瓜籽蛋白質提取效率的影響，結果見表6。

表6 冷榨水分含量對工藝的影響Table 6 The effect of cold pressing water content on process

由表6可知，隨著水分含量增加，南瓜籽蛋白質的提取效率呈先升高后下降的趨勢，當水分含量為10%時，南瓜籽蛋白質的提取效率達到最高，而當水分含量為15%時，南瓜籽蛋白質的提取效率下降，說明水分含量過多不利于南瓜籽蛋白質的提取。

2.4.3 冷榨壓力對工藝的影響

南瓜籽在冷榨過程中的壓榨，主要是由于南瓜籽受壓后固體內外表面受到擠壓，蛋白質被榨出造成的。在相同情況下，蛋白質受到的壓榨程度越大，粒子塑性變形程度越大，提取出的蛋白質成分也就越多。然而，受到某種壓力的影響，冷榨壓縮存在一定限度，即使壓力增加到最大值，壓縮能力也不再增加，此時為不可壓縮體，也就是極限壓力。

工藝反應條件：通過表5確定的最佳冷榨控制溫度為60 ℃，通過表6確定的最佳水分含量為15%，在該溫度和水分含量下，選取冷榨壓力分別為1.0，2.0，3.0，4.0 MPa進行冷榨，由此研究冷榨壓力對南瓜籽蛋白質提取效率的影響，結果見表7。

表7 冷榨壓力對工藝的影響Table 7 The effect of cold pressing pressure on process

由表7可知，隨著冷榨壓力增加，南瓜籽蛋白質的提取效率升高，但變化幅度不大。為了防止在蛋白質提取過程中壓力過大影響提取效率，選擇壓力為3.0 MPa作為工藝提取指標。

2.4.4 冷榨轉速對工藝的影響

工藝反應條件：通過表5確定的最佳冷榨控制溫度為60 ℃，通過表6確定的最佳水分含量為15%，通過表7確定的冷榨壓力為3.0 MPa，在該溫度、水分含量和壓力下，選取冷榨轉速分別為32，34，36，38，40，42，44 r/min進行冷榨，由此研究冷榨轉速對南瓜籽蛋白質提取效率的影響，結果見表8。

表8 冷榨轉速對工藝影響Table 8 The effect of cold pressing rotating speed on process

由表8可知，轉速越大，南瓜籽蛋白質的提取效率也隨之變大，其中當轉速為42 r/min時，南瓜籽蛋白質的提取效率達到最高為66.7%，然而，當轉速為44 r/min時，南瓜籽蛋白質的提取效率卻降低。因此，選擇42 r/min作為蛋白質提取工藝的最佳轉速。

通過上述分析可知，影響南瓜籽蛋白質提取的因素主要為冷榨溫度、冷榨水分含量、冷榨壓力和冷榨轉速，其中當溫度為60 ℃、水分含量為15%、冷榨壓力為3.0 MPa、冷榨轉速為42 r/min時，南瓜籽蛋白質的提取效果最好。為了驗證該情況下提取效果良好，需使用不同提取方法與冷榨法對比，并在紫外分光光度計支持下完成對比分析。

3 結果與討論

將南瓜籽分成3組，每組150 g南瓜籽，使用紫外分光光度計測定蛋白質的純度。選擇5個10 mL比色管，用0.9% NaCl溶液溶解，將蛋白質稀釋成250 mL，3個試管大小為1.5 cm×15 cm×9 cm。分別使用三氯醋酸-丙酮沉淀法、電泳法和冷榨法提取南瓜籽蛋白質，以下為對比內容及結果。

3.1 基本原理

使用紫外分光光度計檢測蛋白質提取效率時，由于蛋白質中含有共軛雙鍵，使蛋白質具有很強的吸收紫外光特性。在一定波長下，分析蛋白質溶液吸光度值與蛋白質溶液濃度的關系，由此獲取蛋白質提取效果。

3.2 試驗步驟

選取光程為1 cm、波長為290 nm、縱坐標為A290、橫坐標為蛋白質濃度的石英比色皿，將1 mL待測蛋白質溶液配以1 mL，加入3 mL蒸餾水，搖動均勻，測定A290。

3.3 測定結果與分析

分別使用三氯醋酸-丙酮沉淀法、電泳法和冷榨法提取蛋白質，其紫外分光光度計測定結果見圖3。

(a)三氯醋酸-丙酮沉淀法

(b)電泳法

(c)冷榨法

3.3.1 三氯醋酸-丙酮沉淀法

使用三氯醋酸-丙酮沉淀法處理南瓜籽時較難，得到的蛋白質濃度不高。當蒸餾水為3.0 mL時，隨著蛋白質濃度增加，吸收紫外光波長也隨之增加，當蛋白質濃度為2.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為235 nm；在蒸餾水為1.5 mL情況下，當蛋白質濃度為2.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為255 nm；在蒸餾水為0 mL情況下，當蛋白質濃度為2.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為260 nm。

3.3.2 電泳法

使用電泳法雖然提取雜質少，但在提取過程中會影響蛋白質遷移速率。當蒸餾水為3.0 mL時，隨著蛋白質濃度增加，吸收紫外光波長也隨之增加，當蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為240 nm；在蒸餾水為1.5 mL情況下，當蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為255 nm；在蒸餾水為0 mL情況下，當蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為270 nm。

3.3.3 冷榨法

使用冷榨法不會破壞南瓜籽的組織結構，當蒸餾水為3.0 mL時，隨著蛋白質濃度增加，吸收紫外光波長也隨之增加，當蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為240 nm；在蒸餾水為1.5 mL情況下，當蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為265 nm；在蒸餾水為0 mL情況下，當蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為290 nm。

通過上述分析結果可知，使用冷榨法能夠提取高純度蛋白質。

4 結論

通過研究確定：

(1)南瓜籽蛋白質的持水能力比持油能力強，蛋白質在pH值為4.5時，溶解度達到最低；

(2)南瓜籽蛋白質比大豆蛋白質的吸水性、吸油性低，而其他特性比大豆蛋白質要高；

(3)冷榨控制最佳溫度為60 ℃，最佳水分含量為15%，最佳冷榨壓力為3.0 MPa，最佳轉速為42 r/min。

通過試驗驗證可知，使用冷榨法不會破壞南瓜籽的組織結構，在蒸餾水為0 mL情況下，蛋白質濃度為3.5 mL時，吸收紫外光波長達到最高，為290 nm，能夠提取高純度蛋白質。