響應面優化水酶法提取青刺果中的抗氧化活性物質及其成分研究

海瀟平，石峰，李思敏，尹金芳，李曉芬，楊志，熊華斌，高云濤

(云南民族大學 化學與環境學院，昆明 650500)

青刺果(PrinsepiautilisRoyle)，屬薔薇科植物，主要分布在海拔為1800～3200 m的西南三省和西藏的高原山地、炎熱峽谷、河灘與灌木叢中[1]。在云南的少數民族聚集地區，青刺果的使用已有數千年之久。因其藥用、食用和保健價值極高，得到了眾多國內外消費者的青睞[2-3]。研究表明，青刺果富含不飽和脂肪酸以及多種營養物質，顯示出調節內分泌、阻止自由基對人體細胞的破壞，具有抗氧化、降血脂、降血糖、減緩衰老、抗腫瘤和增強機體免疫的作用[4-9]。因此，研究青刺果中的抗氧化活性成分有著重要理論意義及應用價值。目前，已有學者利用多種技術從青刺果中提取活性成分，例如溶劑提取法、壓榨法和蒸餾法等，但這些方法工序繁瑣、耗時長、提取率低，還易造成其抗氧化活性物質活性下降[10]。超臨界CO2萃取法雖然提取效率高，且抗氧化物質活性得到了最大程度的保留，但設備成本昂貴，限制了規模化應用。低溫萃取技術在實際應用中丙烷、丁烷等有機試劑容易殘留，可能會引發食品安全等問題[11]。

水酶法條件溫和、耗能低、提取產物品質好，且降低了設備投資和提升了工藝操作的安全性和經濟性等[12-13]，現已有諸多國內外學者將該法應用于大豆、花生和玉米等中[14-15]，但在青刺果中的應用尚未見相關報道。鑒于此，本研究將高原特色青刺果在膠體磨研磨的基礎上，利用超聲輔助水酶法提取青刺果中的抗氧化活性物質，以DPPH·的清除率為評價標準，篩選對該工藝的影響因素，采用響應面法優化得到最佳工藝，并利用氣質聯用儀(GC-MS)分析其抗氧化活性成分，以期為開發和利用青刺果提供理論依據，為山區農民脫貧致富提供一個有效的途徑[16-17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青刺果：購于云南省麗江市。

中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶、木瓜蛋白酶、氨肽蛋白酶：鄭州萬搏化工產品有限公司；酸性蛋白酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶：滄州夏盛酶生物技術有限公司；二苯基苦肼基自由基(DPPH)：美國Sigma公司；超純水：Ashland公司；無水乙醇、雙氧水、水楊酸、硫酸亞鐵(均為分析純)：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AR224CN電子分析天平 云南科儀化玻有限公司；JM-L65膠體磨 溫州佐佳機械科技有限公司；SJIA-2012超聲波細胞破碎機 上海力辰儀器科技有限公司；8453型紫外可見分光光度計、Agilent 7890A氣相色譜儀 美國Agilent公司；TDL80-2B離心機、HH-4數顯恒溫水浴鍋 長沙毫厘科技有限公司；ZK82J電熱真空干燥箱 滬越儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青刺果前處理及光譜掃描

前處理：將青刺果干燥至恒重，稱取一定量的青刺果與適量體積水混合，用膠體磨研磨后混合均勻得到實驗樣液備用。

準確量取青刺果樣液30 mL，移至200 mL燒杯中，稱取并加入2 g中性蛋白酶，置于55 ℃水浴鍋中，反應2 h，酶滅活組水浴溫度為75 ℃，在轉速為4000 r/min的條件下離心10 min，取上清液并稀釋5倍為備測液，于波長190～800 nm內進行光譜掃描。

1.3.2 DPPH·與·OH清除能力的測定

同1.3.1操作，量取備測液體0.5 mL一份，加入5 mL DPPH·(A=0.7±0.1)溶液，充分搖勻反應90 s，在517 nm波長處測量提取液的吸光度AX，空白組的吸光度A0，并使用下式計算抗氧化物質對DPPH·的清除率[18-19]。

DPPH·清除率(%)=[1-(AX-A0)/A]×100%。

同1.3.1操作，量取備測液體0.5 mL于反應管中，加入2 mmol/L的FeSO40.5 mL、6 mmol/L H2O20.5 mL后搖勻，再加入6 mmol/L水楊酸0.5 mL，搖勻，于37 ℃水浴中恒溫15 min后，在波長為510 nm處測定其吸光度AS；另取蒸餾水0.5 mL于反應管中，操作如前，其吸光度為A0。按照下式計算抗氧化物質對·OH的清除率[20]。

·OH清除率(%)=[(A0-AS)/A0]×100%。

1.3.3 酶種類對青刺果抗氧化物質提取的影響

選擇8種不同的酶進行實驗：中性蛋白酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、氨肽蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、木瓜酶和堿性蛋白酶，空白組為蒸餾水。準確量取30 mL(±0.01 mL)青刺果樣液和稱取各酶，置于8個200 mL燒杯中，在55 ℃下反應2 h。以4000 r/min的轉速離心10 min，量取上清液并稀釋5倍作為備測液體。分別取備測液體0.5 mL，加入5 mL DPPH·(A=0.7±0.1)溶液，充分搖勻90 s，在517 nm波長處測其吸光度，計算DPPH·的清除率，平行實驗5次。

1.3.4 單因素實驗

以抗氧化活性物質對DPPH·的清除率為評價標準，使用最優的酶種類，分別對酶解溫度、加酶量、底物濃度、超聲功率和超聲時間進行篩選實驗。

2 結果與分析

2.1 提取物的最大吸收峰

圖1中UV-Vis光譜掃描結果顯示，青刺果溶液在400～800 nm間不存在特征吸收峰，DPPH·于328，517 nm處出現兩個較強的特征吸收峰，而在198 nm波長處出現青刺果溶液的特征峰。所以,本實驗選用198 nm作為青刺果溶液的最大吸收波長。

圖1 提取物的最大吸收峰

2.2 DPPH·與·OH清除能力的測定

由表1可知，青刺果提取液對DPPH·和·OH的清除效果基本一致，但DPPH·清除率略高，這可能與青刺果中抗氧化活性成分的結構有關[21]，本研究后續實驗選擇對DPPH·的清除能力作為測定青刺果中抗氧化物質活力強弱的標準。

表1 DPPH·與·OH清除能力的測定(x±s, n=5)Table 1 The determination of DPPH· and ·OH scavenging rates (x±s, n=5) %

2.3 酶種類對青刺果提取物清除DPPH·的影響

由圖2可知，選擇8種酶與青刺果提取液反應，數據顯示中性蛋白酶對DPPH·的清除效果最為顯著，清除率可高達77.09%，這可能是因為青刺果中特有的油脂、蛋白質等天然有機化合物對中性蛋白酶的活力有著促進作用[22-23]，因此，本實驗選用中性蛋白酶用于后續操作。

圖2 不同酶對青刺果提取液清除DPPH·的影響Fig.2 Effect of different enzymes on DPPH· scavenging ability of Prinsepia utilis Royle extracting solution

2.4 酶解溫度對青刺果提取物清除DPPH·的影響

由圖3可知，青刺果中抗氧化物質的提取受酶解溫度的影響顯著，隨著酶解溫度的上升，清除率也隨之提高，當酶解溫度為55 ℃時清除率達到81.77%，然后呈現出下降的趨勢。這是由于大多數抗氧化活性物質對溫度有極高的敏感性，如對辣木葉中黃酮提取工藝的研究顯示，過高的酶解溫度會使酶失活，還會使抗氧化成分的生物活性降低[24]。考慮到對青刺果提取物中抗氧化成分的活性價值的最大程度保存，后續實驗中以55 ℃作為最適宜的提取溫度。

圖3 酶解溫度對青刺果提取液清除DPPH·的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on DPPH· scavenging ability of Prinsepia utilis Royle extracting solution

2.5 加酶量對青刺果提取物清除DPPH·的影響

由圖4可知，隨著加酶量的增多，DPPH·的清除率隨之提高，說明加酶量的增多，使得酶與底物的作用頻率提高。當加酶量為2 g時，DPPH·清除率達81.53%，而后，過多的酶導致提取液過于黏稠，作用機率降低，DPPH·清除率就會減慢[25]。因此，確定實驗最佳加酶量為2 g。

圖4 加酶量對青刺果提取液清除DPPH·的影響Fig.4 Effect of enzyme additive amount on DPPH· scavenging ability of Prinsepia utilis Royle extracting solution

2.6 底物濃度對青刺果提取物清除DPPH·的影響

由圖5可知，底物濃度過高或過低都會對青刺果中抗氧化物質的提取有影響，在底物濃度為5%的情況下，DPPH·的清除率為81.97%。而后清除效果呈下降趨勢，原因是底物濃度的增大，使中性蛋白酶與青刺果提取物作用的空間不斷減小，導致酶解效果下降[26]。因此后續實驗選擇底物濃度為5%。

圖5 底物濃度對青刺果提取液清除DPPH·的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on DPPH· scavenging ability of Prinsepia utilis Royle extracting solution

2.7 超聲功率對青刺果提取物清除DPPH·的影響

眾多研究顯示，超聲技術對提取物中抗氧化物質有很大幫助，能幫助其中抗氧化成分的提取和釋放[27]。本實驗通過加入超聲技術對水酶法提取青刺果中抗氧化物質的實驗參數進行了完善。由圖6可知，由于功率不斷加大，DPPH·的清除率先提高后降低，在120 W時達到82.56%。下降的原因可能是功率過大，將青刺果細胞破碎成過小的顆粒，影響了活性物質的結構[28]。因此，確定超聲功率為120 W。

圖6 超聲功率對青刺果提取液清除DPPH·的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on DPPH· scavenging ability of Prinsepia utilis Royle extracting solution

2.8 超聲時間對青刺果提取物清除DPPH·的影響

由圖7可知，超聲時間在10～30 s這個時間段內，DPPH·的清除率近似直線式上升，最高達到83.09%。超過30 s后，持續延長時間清除率反而下降，這是因為對青刺果中抗氧化物質已達到最大限度的提取，此后超聲時間的延長并無實際意義，這與方芳、葉茂等[29]的研究結果一致。

圖7 超聲時間對青刺果提取液清除DPPH·的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time on DPPH· scavenging ability of Prinsepia utilis Royle extracting solution

2.9 超聲輔助水酶法提取青刺果抗氧化物質的響應面法優化

2.9.1 CCD設計實驗及其實驗結果

本研究采用響應面法優化，建立影響條件和其響應值的關系，以此選出實驗的最佳提取條件。在討論青刺果提取物清除DPPH·的過程中，發現超聲時間、酶解溫度和超聲功率作用比較突出，所以將這3個因素作為響應面分析因素。采用 Expert 8.1.6 軟件中的Central Composite Design(CCD)法對清除體系中的3個因素對DPPH·清除率進行探究。根據 CCD 設計原理，對這3個因素的分別設置3個水平，見表2。

表2 CCD實驗設計因素與水平值Table 2 The factors and levels of CCD experiment design

根據CCD實驗設計，以酶解溫度為自變量A、超聲功率為自變量B和超聲時間為自變量C，響應值 R為青刺果中抗氧化物質對DPPH·的清除率，通過 Expert 8.1.6分析軟件得到的CCD實驗設計方案以及依照方案進行實驗得到的結果見表3。

表3 CCD實驗設計及實驗結果

2.9.2 回歸和方差分析

以實驗結果為響應值，對3個因素做出二次線性回歸分析，R與各實驗條件之間的方程如下：

R清除率= 85.30+2.32A+1.56B-2.20C-0.75AB+1.95AC+2.25BC-2.02A2-2.36B2- 1.72C2。

得到的模擬方程相關性較好，相關系數 R2= 0.9688，本實驗對回歸模型進行了方差結果分析，見表4。

表4 青刺果提取液清除DPPH·的回歸方差分析結果Table 4 The regression variance analysis results of DPPH· scavenging rates of Prinsepia utilis Royle extracting solution

由表4可知，P<0.0001表現出了高度顯著水平，證明模型合理、方法可靠，可用于青刺果中抗氧化物質提取的響應面分析。除AB項外，其他項都滿足P<0.05，呈現高度顯著影響，證明這3個因素均可作為主要因素影響實驗結果，其中，P<0.001的有A項和C項，即證實酶解溫度和超聲時間對結果的影響極為突出，而B項的P<0.05，表明超聲功率對實驗結果的作用效果相對較弱。AC項和BC項的P<0.01，這說明酶解溫度和超聲時間及超聲功率和超聲時間在特定條件下表現出交互作用，但是酶解溫度和超聲功率之間沒有表現出這個效應。

2.9.3 提取青刺果抗氧化物質的響應面分析

酶解溫度(A)、超聲功率(B)和超聲時間(C)3個因素對DPPH·清除率的 3D 響應面圖見圖8。

a.酶解溫度與超聲功率

b.酶解溫度和超聲時間

c.超聲功率和超聲時間

由圖8中a可知，從A方向觀測，響應面曲線走勢尤為陡峭，與之相對，B方向走勢相對平緩。因此，相較于超聲功率，酶解溫度對該提取工藝的作用效果更為突出。由圖8中b可知，A 因素的曲線斜度明顯大于C 因素，表明清除率受酶解溫度的影響更大。由圖8中c可知，相較于B因素，沿C因素方向曲線的走向趨勢陡峭且切峰值較大，說明C因素對實驗結果的作用更強。響應面分析清晰說明了各因素對DPPH·清除率的影響程度，其分析效果全面，更具有說服力。通過響應面的歸納總結可以得出，3個影響條件對該提取工藝的作用大小為A>C>B。

此外，利用響應面法優化得最優提取工藝條件：酶解溫度為56.91 ℃，超聲功率為122.96 W，時間為26.42 s，預測的最優清除率為86.208%。通過最優條件的提取工藝所得的實驗結果接近預測值，達到85.88%±0.15%，僅相差0.328%，·OH的清除率為85.42%±0.27%，再次驗證該方案可行。實驗結合超聲技術并優化提取工藝參數，使得青刺果中抗氧化物質對DPPH·的清除率有了較大的提高，此結果與丁香中總黃酮[30]和桑葚花色苷[31]呈現出來的結論一致。

2.10 青刺果中抗氧化物質的GC-MS分析

本實驗利用GC-MS分析青刺果提取液以及加入DPPH·的青刺果混合溶液中的成分，運用氣質色譜聯用儀對色譜中的各峰進行解析，結果見表5和表6。

表5 青刺果提取液成分分析

表6 加入DPPH·的青刺果提取液的成分分析

膠體磨處理的青刺果提取液的氣相色譜圖見圖9，結合圖9和表5可知，青刺果溶液中可分離出8種物質；加入DPPH·的青刺果提取液的氣相色譜圖見圖10，結合圖10與表6可知，反應的混合溶液中能分離出4種物質。經兩溶液對照分析得出，DPPH·與青刺果溶液的混合溶液中有8種物質的峰消失，表明這8種成分均能與DPPH·溶液反應，同時也有新的成分產生。本分析說明，青刺果溶液中存在著多種能清除DPPH·的成分，其中油酸酰胺和棕櫚酰胺等不飽和脂肪酰胺類物質成分達69.44%，這與前人的研究結果相一致[32]。

圖9 青刺果提取液GC-MS譜圖

圖10 加入DPPH·的青刺果提取液的GC-MS譜圖

3 結論

本研究利用超聲輔助水酶法對青刺果中的抗氧化活性物質進行提取，通過對8種酶進行篩選，證明中性蛋白酶作用效果最佳，進行單因素篩選后結合響應面法優化，得出最佳提取條件：底物濃度5%，酶解溫度57 ℃，加酶量2 g，超聲功率120 W，超聲時間26 s，可獲得85.88%的DPPH·清除率，與響應面預測最佳結果比較接近。通過GC-MS分析法鑒定出青刺果中含多種能清除DPPH·的物質。綜上，該工藝可對青刺果中的抗氧化活性物質進行高效提取，可為青刺果的多領域深加工提供依據，為山區農民提供一個脫貧致富的有效途徑。