四川泡青菜發酵過程中特征香味物質演變規律研究

張杰，徐飛，詹軍，夏金川，趙志峰*，蔣茜，王佐軍

(1.四川大學 輕工科學與工程學院，成都 610065；2.四川李記樂寶食品有限公司，四川 眉山 620036；3.四川李記醬菜調味品有限公司，四川 眉山 620030)

泡青菜是四川泡菜中的一種，其風味濃郁醇香、酸爽可口，是川菜制作的必備佐料。原料青菜經腌制發酵后產生的香味物質可以減輕其原有的辛辣刺激味，產生適宜的辛辣味，并賦予泡青菜獨特風味。泡青菜的發酵過程是香味物質種類和數量不斷演替變化的過程，泡青菜特有風味的產生是多種香味物質相互作用的結果。現已有學者對泡菜發酵過程中香味物質的組成做了研究，例如：姚英政[1]采用氣相色譜-質譜聯用儀對不同腌制時期(原料、發酵1年、發酵2年、發酵3年)的冬菜進行了香味物質分析，研究發現不同時期的發酵冬菜中共檢測出70種香味物質，其中，在不同發酵時期樣品中均檢測出的香味物質成分有3種，分別為苯乙醇、異硫氰酸烯丙酯和苯甲醛。張華芳等[2]對腌制7，14，21，28 d泡菜的香味物質進行研究，共檢測出92種，當腌制至成熟過程時，酯類、酸類、醇類和腈類物質含量均有所增加，而烴類、醛類物質含量呈現下降趨勢。四川泡青菜的傳統制作需要經歷6個月以上，有時受貨物積壓的原因，發酵時間甚至超過1年，在此發酵周期內，泡青菜的風味變化十分明顯；而現有研究大多脫離了工業生產實際，取樣間隔過短或過長，不能真實地反映出工業化泡菜發酵周期內香味物質的演變規律。

本研究以工業化四川泡青菜為研究對象，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)結合氣相色譜-質譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)聯用技術對發酵18個月內的產品進行香味物質研究，為四川泡菜的風味研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

發酵時間為0個月(即泡青菜原料)、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月、12個月、15個月和18個月的泡青菜樣品，編號分別為0M、1M、2M、3M、4M、5M、6M、7M、8M、9M、10M、11M、12M、15M和18M，均取自四川李記醬菜調味品有限公司。

1.1.2 儀器

BMS-220分析天平 上海卓精電子科技有限公司；DZKW-4電子恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；GCMS-QP2010 SE氣相色譜-質譜聯用儀 日本Shimadzu公司；DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱 美國Agilent公司；SPME手動進樣裝置(包括SPME手動進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭(24Ga,3pk)) 美國Supelco公司。

B

A

1.2 實驗方法

1.2.1 香味物質的提取

參考汪冬冬等[3]的研究方法并加以修改。準確稱取5.00 g泡青菜樣品，切碎后加入樣品瓶中，蓋好后置于40 ℃恒溫水浴30 min，將已活化好的萃取頭插入瓶中，推出纖維頭，使之與樣品保持1.5 cm的距離，萃取溫度40 ℃，萃取時間15 min。待萃取結束后抽回纖維頭，拔出萃取頭，再將萃取頭插入GC進樣口，推出纖維頭，于250 ℃條件下解吸5 min，抽回纖維頭后拔出萃取頭，同時啟動儀器并采集實驗數據。

1.2.2 香味物質的鑒定

色譜條件：HP-5MS彈性毛細管柱(30 m×0.125 mm×0.125 μm)；載氣：氮氣，不分流進樣；流速為1 mL/min；柱溫程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持3 min；從40 ℃升到130 ℃，速率為5 ℃/min，而后在130 ℃保持5 min；從130 ℃升到155 ℃，速率為25 ℃/min，然后從155 ℃升到220 ℃，速率為5 ℃/min，在220 ℃保持5 min，進樣口溫度為240 ℃。

質譜條件：離子源溫度220 ℃；電子能量70 eV，傳輸線溫度220 ℃；接口溫度280 ℃，掃描范圍(m/z)：50～550。

1.3 數據處理與分析

將所測香味物質的質譜信息與數據庫中已知香味物質的質譜信息進行比對，根據相似度的高低進行定性；再根據被測化合物占所有化合物總色譜峰面積之比，來計算被測組分的相對含量。所得香味物質定性、定量結果采用Origin 9.1軟件進行繪圖，最后采用SPSS 25.0軟件對主體香味物質進行聚類分析。

2 結果與討論

2.1 不同發酵時期泡青菜香味物質的對比分析

續 表

表2 不同發酵時期泡青菜香味物質種類的變化

研究表明，四川泡青菜中的香味物質有三大來源：一是泡菜原料，包括蔬菜和香辛料本身的香味物質，如蒜中的硫丙醛-S-氧化物[4]、蘿卜中的醇類和萜類[5]、芥菜中的異硫氰酸烯丙酯[6]；二是乳酸菌發酵產生的香味物質，如乙酸、丁酸、乳酸、丙酸、琥珀酸、乙烯、丁二醇、乙醇、乙酸乙酯和乳酸乙酯等[7]；三是其他菌群的發酵作用產生的香味物質，如醋酸菌、酵母菌等[8]。

不同發酵時期泡青菜的GC-MS圖譜見圖1。香味物質的種類和相對含量變化對比見圖2。

圖1 不同發酵時期泡青菜香味物質的總離子流圖

由圖1和圖2可知，通過頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術共檢測出8類共計285種香味物質。泡青菜原料主要香味物質種類為烴類和酯類，發酵1～5個月的泡青菜主要香味物質種類為醇類和酯類，發酵6～9個月的泡青菜主要香味物質種類為烴類和酯類，發酵10～11個月的泡青菜主要香味物質種類為烴類和醇類，發酵12～18個月的泡青菜主要香味物質種類為烴類和酮類。發酵18個月期間，烴類、酮類和酯類具有較為明顯的變化趨勢，具體表現為隨著發酵時間的延長，烴類和酮類物質相對含量增加；酯類物質分為含硫的氰酸酯類和其他短鏈脂肪酸酯類，氰酸酯類主要來源于原料本身，在泡青菜未成熟時產生辛辣味[9]，相對含量占比最高，在發酵9個月時由于氰酸酯類被酶和微生物分解，因而辛辣味逐漸減弱，而其他短鏈脂肪酸酯類增加；但是當發酵時間延長至18個月時，無論是氰酸酯類還是其他短鏈脂肪酸酯類相對含量均顯著下降。

2.2 不同發酵時期泡青菜主體香味物質分析

根據不同發酵時間泡青菜中各類香味物質的含量(見圖3)，采用系統聚類樹法將樣品進行聚類分析，不同發酵時期主體香味物質相對含量的變化情況見表3。

圖3 不同發酵時期泡青菜聚類分析圖

表3 不同發酵時期泡青菜主體香味物質相對含量變化

由圖3可知，當設定距離為10時，整個發酵周期內的泡青菜可以分為8個發酵階段，其中0～3個月為第一階段，4個月和5個月分別為第二、三階段，6～7個月為第四階段，8～9個月為第五階段，10～12個月為第六階段，15個月和18個月分別為第七、八階段。根據聚類分析結果并結合表1不同時期香味物質種類總相對含量和表3主體香味物質相對含量變化情況可知，整個發酵周期內的泡青菜可以分為5個不同階段，即發酵前期0～5個月，發酵中前期6～9個月，發酵中后期10～12個月，發酵后期15個月，發酵末期18個月。

表1 不同發酵時期泡青菜香味物質相對含量的變化

發酵前期0～5個月，泡青菜原料(0個月)中主體香味物質有2種，分別為異硫氰酸烯丙酯和異硫氰酸環丙酯，相對含量分別為9.06%和75.33%；原料中異硫氰酸酯類含量高，隨著發酵的進行，異硫氰酸酯被酶和微生物分解，使蔬菜原料中的辛辣味逐漸減弱。發酵1個月時增加了乙醇和乙酸，乙醇和乙酸的產生是由于微生物的作用，是微生物的代謝產物[10]。發酵第2，3，4，5個月時，主體香味物質種數越來越豐富，主體香味物質酯類中的異硫氰酸酯類相對含量不斷下降，這可能是隨著發酵時間延長，芥子苷酶的活性在此階段急劇下降，異硫氰酸酯類等酶解產物的含量也相應地下降；同時，在乳酸菌等微生物的發酵作用下，整個體系的 pH 值不斷下降，在 pH 降低的情況下，芥子苷在芥子苷酶的作用下主要生成其他化合物。即發酵前期0～5個月，主要呈現濃郁醇香和辛辣味。

發酵中前期6～9個月，從主體香味物質組成上分析，6個月和7個月的泡青菜共有主體香味物質最多，共有組分分別為α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、姜烯、1-甲基-4-(1-亞甲基-5-甲基-4-己烯基)環己烯、(+)-2-Carene、桉葉油醇、異硫氰酸烯丙酯和乙酸芳樟酯，α-姜黃烯、姜烯和β-倍半水芹烯是姜黃精油的主要香味物質，屬于萜烯類化合物，普遍易揮發，閾值低[11]；桉葉油醇有樟腦氣息和清涼的草藥味道[12]；異硫氰酸烯丙酯具有催淚作用，適量地存在可賦予泡青菜特有的芥辣味[13]；乙酸芳樟酯具有類似薰衣草、鈴蘭等的幽雅香氣[14]。除此之外，發酵6個月的泡青菜還含有乙酸乙酯，具有果香的酒香味[15]；發酵7個月的泡青菜還含有(E)-β-金合歡烯，主要存在于甜玫瑰油、橙油和桔子油等中。發酵8個月和9個月的泡青菜共有的主體香味物質只有3種，分別為姜烯、丙二醇和乙酸芳樟酯；發酵8個月的泡青菜特有的主體香味物質為β-倍半水芹烯和三醋酸甘油酯；發酵9個月的泡青菜特有的主體香味物質為乙酸和異硫氰酸烯丙酯。發酵6～9個月時，泡青菜已逐漸趨于成熟，以烴類和酯類物質為主要香型貢獻者，呈現濃郁花果香、較淡辛辣味。

發酵中后期10～12個月的泡青菜共有的主體香味物質為α-姜黃烯、(E)-β-金合歡烯、姜烯、1-甲基-4-(1-亞甲基-5-甲基-4-己烯基)環己烯、(+)-2-Carene、桉葉油醇、Tumerone、乙酸和二硫化碳；發酵10個月的泡青菜特有的主體香味物質為丙二醇、Ar-tumerone和異硫氰酸烯丙酯，發酵11個月特有的主體香味物質為β-倍半水芹烯和異硫氰酸烯丙酯，發酵12個月特有的主體香味物質為β-倍半水芹烯、Ar-tumerone和乙酸乙酯。當發酵10～12個月時，發酵酸香逐漸增強，此時以烴類、酮類和酸類物質為主要香型貢獻者，呈現濃郁花果香和發酵酸香，以及較淡辛辣味。

發酵后期15個月泡青菜的主體香味物質種類為α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、4-蒈烯、姜烯、芳姜黃酮、Tumerone、丁酸和異硫氰酸環丙酯。發酵末期18個月泡青菜的主體香味物質種類為α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、姜烯、Cyclohexene, 4-methyl-3-(1-methylethylidene)-、桉葉油醇、芳姜黃酮、Tumerone、丁酸、異硫氰酸環丙酯和硫脲。當泡青菜發酵時間延長至15個月和18個月時，不再因為發酵時間的延長，風味向好，泡青菜發酵15個月香型的貢獻者為烴類和酮類，泡青菜發酵18個月香型的貢獻者為烴類和其他類。發酵后期(15個月)和發酵末期(18個月)的泡青菜均主要呈現濃郁花果香及微微辛辣味和發酵酸香。

綜上所述，泡青菜發酵前期(0～5個月)主體香味物質主要以醇類和酯類為主，呈現濃郁醇香和辛辣味；發酵中前期(6～9個月)主體香味物質為烴類和酯類，呈現濃郁花果香、較淡辛辣味；發酵中后期(10～12個月)主體香味物質為烴類、酮類和酸類，呈現濃郁花果香和發酵酸香，以及較淡辛辣味；發酵后期(15個月)主體香味物質為烴類和酮類，發酵末期(18個月)主體香味物質為烴類和其他類，發酵后期和發酵末期的泡青菜均主要呈現濃郁花果香及微微辛辣味和發酵酸香。隨著發酵時間的延長，烴類、酮類物質呈增加趨勢，酯類、醇類物質呈下降趨勢。

3 結論

使用HS-SPME-GC-MS解析了14個不同發酵時間四川工業化泡青菜中的香味物質變化，最終共檢測出8類，285種香味物質，其中有26種為主體香味物質，相對含量大于5%。并結合聚類分析發現，發酵18個月的泡青菜可以分為5個發酵階段，即發酵前期0～5個月、發酵中前期6～9個月、發酵中后期10～12個月、發酵后期15個月、發酵末期18個月。并且α-姜黃烯、β-倍半水芹烯、(E)-β-金合歡烯、姜烯、乙醇、桉葉油醇、芳姜黃酮、乙酸、異硫氰酸烯丙酯、異硫氰酸環丙酯、異硫氰酸異丁酯、乙酸乙酯和乙酸芳樟酯，對泡青菜的風味形成有重要貢獻。泡菜類發酵產品一直有“發酵時間越久，越香”的說法，但根據本研究結果來看，當處于發酵后期時，其香味物質的種類及含量并非越來越好，本研究的成果或許可以為泡青菜生產企業改良生產方式、提高企業效益提供一定借鑒。