廣西武宣地區紅糟酸微生物多樣性分析

李洋，羅佳沂，林鳳，毛瑞豐，李凱

(廣西大學 輕工與食品工程學院，南寧 530004)

紅糟酸(red vinasse acid)是產于廣西來賓市武宣縣的一種風味獨特的食物，其顏色鮮艷、酸甜適口，可謂是色、香、味俱全，而且紅糟還可以促消化，具有一定保健作用，深受當地人民的喜愛。紅糟酸是在稍高于室溫的環境溫度下，將紅糟配上適量醋和米酒，與煮熟的米飯拌勻，然后清洗、發酵、晾涼，投入辣椒、生姜等泡制而成。紅糟酸不僅色鮮味濃，而且具有對人體有益的功效，例如軟化血管、幫助消化、增加食欲等，是一種老少皆宜的食品[1]。

紅糟酸的品質與微生物的代謝有密切聯系，例如醋酸桿菌屬、片球菌屬、乳酸桿菌屬等，但不同地區由于制作原料及制作環境的影響，對紅糟酸中的微生物種類及含量也會有一定影響，目前對不同發酵時間和不同地區產紅糟酸的差異性研究比較少。

高通量測序技術(high-throughput sequencing，NGS)，又稱“下一代”測序技術，一次可以對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行序列測定，這種測序技術已經在發酵食品及環境生物中廣泛應用，用于微生物群落的分析[2-3]。沈琦等[4]利用高通量技術分析了鹽地堿蓬根際細菌群落多樣性，檢測出355個屬，變形菌門的細菌屬占比接近50%；Chen等[5]采用PCR-DGGE技術探究泡菜發酵中優勢微生物菌群以及動態變化規律，揭示了泡菜中微生物的多樣性。本實驗采用高通量測序技術對武宣縣不同村莊的紅糟酸成品及發酵過程進行微生物多樣性分析，為提高紅糟酸的品質提供了一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料、試劑與儀器

1.1.1 實驗材料

樣品地理位置情況(見圖1)：廣西壯族自治區來賓市武宣縣(北緯23°19′～23°56′，東經109°27′～109°46′)，東北面與金秀縣為界，西南面與桂平市、貴港市毗鄰，西面與來賓市興賓區接壤，北面與象州縣交界，縣境面積1739.45 km2，東西最大橫距50.2 km，南北最大縱距68.6 km。武宣縣地處廣西中部，屬亞熱帶季風氣候區。北回歸線橫貫武宣縣南部，全年太陽輻射強。春秋干旱較頻繁，夏多洪澇，冬有霜凍。年平均氣溫為21.3 ℃。雨水充沛，分布不均，年平均降雨量為1243.6 mm。

圖1 采樣點位置圖

樣品：樣品DX、ET、SL、HM以及7個發酵過程樣是來賓市武宣縣不同村莊的紅糟酸。

1.1.2 主要試劑

1.1.3 主要儀器

1.2 實驗材料、試劑與儀器

1.2.1 樣品的收集與處理

收集：2020年8月下旬，在來賓市武宣縣4個地點，各收集1種成品紅糟酸及7種發酵過程中的紅糟酸，裝入無菌密封塑料袋中，置于冰盒中，快速運輸至實驗室后在-20 ℃條件下冷凍保藏待用。

處理：稱取200 mg紅糟酸汁，加入滅菌后的2 mL離心管中，加入1×PBS溶液，振蕩混勻，以10000 r/min在室溫下離心3 min，棄置上層液體。

1.2.2 總DNA的提取

按Omega DNA提取試劑盒說明書，從11個紅糟酸樣品中提取微生物總DNA，利用瓊脂糖凝膠檢測DNA的完整性，用Qubit定量檢測DNA樣本濃度。16S rRNA和ITS序列分析：進入NCBI數據庫，采用BLAST分別對所得細菌和真菌目標序列與標準菌株序列進行比對，刪除結果中錯位區、冗雜區，將處理好的目標序列與標準菌株序列采用MEGA 7.0軟件[6]計算序列的堿基組成百分比(nucleotide composition)[7]，基于Kimura 2-parameter模式對上述目標菌株與標準菌株進行遺傳距離計算[8]，基于neighbor-joining (NJ)法構建系統發育樹[9]，并對系統發育樹各分支的置信度進行檢驗[10]。

1.2.3 高通量測序

擴增程序[11]：95 ℃預變性 3 min；95 ℃變性 30 s，45 ℃退火20 s，72 ℃延伸45 s，共20個循環；72 ℃再延伸10 min。利用Min Eluter PCR Purification Kit對PCR擴增產物進行純化,PCR擴增產物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化目的產物后，委托生工生物工程(上海)股份有限公司進行高通量建庫與微生物多樣性分析。

1.2.4 實驗數據分析

根據97%相似性，將非重復序列進行操作分類單元(OTU)聚類。利用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU進行分類學分析[12]，統計不同地區和發酵時間紅糟酸樣品的微生物在不同水平的群落組成。利用Mothur軟件繪制稀釋性曲線，利用QIIME[13]軟件計算樣品的各種多樣性指數，利用Excel軟件構建群落分布柱狀圖、數據分析表等。

2 結果與分析

2.1 OTU聚類分析

在分析中引入OTU分析，首先對相似序列進行聚類，分成數量較少的分類單元進行分析，即OTU聚類分析，既可以簡化數據結構，也可去除一些測序錯誤序列，從而得到樣品中的微生物多樣性及不同微生物的豐度。

由圖2可知，4個樣品共有的細菌OTU數為77個，HM和SL無特有的OTU，ET和DX各有1個，樣品共有的真菌OTU數為5個。

圖2 成品樣微生物OUTs Venn圖

由圖3可知，7個過程樣共有的細菌OTU數為84個，共有的真菌數為8個。紅糟酸制作前，需將紅曲米種子用白醋泡發，打成勻漿，從而改變其發酵環境，降低發酵過程中的pH值，導致部分微生物的生長被抑制。真菌對于低pH環境具有耐受性，從而使其OTU數在發酵中期回升。

圖3 過程樣OUTs Venn圖

2.2 Alpha多樣性分析

Alpha多樣性指一個生態系統或特定環境中的多樣性，主要用于反映物種豐度、均勻度、測試深度。

續 表

由表1和表2可知11個樣品的細菌和真菌群落多樣性。在觀察到的樣品物種數和物種豐度指數中，D15是7個發酵樣(Seeds～D15)中細菌物種總數相對較大的，在成品對比中，SL是成品紅糟酸中細菌物種總數和物種豐度最高的；通過Shannon和Simpson值可以看出，細菌的多樣性在發酵過程中略有波動，且在成品紅糟酸中細菌多樣性最高。由表2可知，11個樣品中D6、D9和D15的真菌物種總數較大，且樣品中真菌多樣性波動較小。Alpha多樣性指數顯示過程樣與成品樣之間波動較大。

表1 樣品細菌群落Alpha多樣性指數

表2 樣品真菌群落Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity indexes of fungal communities of samples

2.3 紅糟酸中微生物群落結構分析

2.3.1 成品樣中微生物群落分析

由圖4可知，醋酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和片球菌屬在紅糟酸成品中占比較高，醋酸桿菌屬在樣品HM、SL和ET中較多，分別占比55.88%、53.99%和50.89%，醋酸桿菌屬可以氧化乙醇成醋酸[14]，是樣品HM、SL和ET主要的產酸途徑，DX中較少，占比6.46%，可能與當地的生產環境有很大關聯。克雷伯氏菌屬在DX中占比最多，約為80.52%，這種菌屬如果含量過高，可能會對紅糟酸的品質和口感有影響。片球菌屬能賦予食品柔和的酸味及香氣，改進食品的品質和營養，具有耐酸、耐高溫特點，還具有抗腫瘤、降低膽固醇的生物學功能[15-16]，在SL中占比較多，為25.8%，在HM、ET和DX中分別占比9.97%、8.44%和3.64%。乳酸桿菌屬可以產生乳酸和多種抗菌物質，乳酸桿菌屬細胞內碳水化合物活性酶存在特異性[17]，在發酵過程中，乳酸的數量影響發酵的質量，乳酸菌屬在樣品HM、SL、ET和DX中分別占比1.42%、5%、10.43%和0.4%。伯克霍爾德菌屬在HM、SL、ET和DX中分別占比3.63%、3.83%、2.86%和2.88%，有研究表明伯克霍爾德菌屬中的大多數物種都使用氧氣作為電子受體降解芳香化合物。阪崎腸桿菌屬在HM、SL、ET和DX中分別占比0.85%、0.004%、0.57%和2.4%，此菌屬耐高溫、不耐酸[18]。芽孢桿菌屬通過代謝產酸，在ET和DX中均未檢出，在HM中占比小于1，為0.019%，在SL中為3.61%，不動桿菌屬通過代謝消耗碳水化合物產酸，在HM、SL和DX中占比均小于1，分別為0.13%、0.16%和0.12%，在ET中占比1.17%。在屬水平上，紅糟酸成品真菌優勢菌均為紅曲霉，在HM和SL中有一定比例的念珠球菌，但占比均較低。總的來說，4種成品紅糟酸中，DX與 SL、HM及ET的菌間差異較大，DX優勢菌屬為克雷伯氏菌，其他菌種相對豐度較小；SL、HM和ET優勢菌屬為醋酸桿菌，且在HM中相對豐度最高，SL中片球菌相對豐度較HM和ET高，ET中乳酸菌相對豐度較SL和HM高，其余菌屬在4種樣品中均占比較低，這可能與當地的氣候以及操作環境和方法有關。

圖4 屬水平成品樣群落結構

2.3.2 過程樣中微生物群落分析

由圖5可知，在屬水平上，伯克霍爾德菌屬和克雷伯氏菌屬在整個發酵過程中占比較大。其中，伯克霍爾德菌屬、克雷伯氏菌屬和未分類菌在種子中占比較大，分別為60.97%、10.35%和9.89%。發酵到第3天，克雷伯氏菌屬含量大量減少，伯克霍爾德菌屬和未分類菌有所增加，分別為40.49%、34.4%和14.78%。發酵到第6天，伯克霍爾德菌屬、克雷伯氏菌屬和乳酸桿菌屬為優勢菌，分別為37.69%、36.62%和14.29%。發酵到第9天，乳酸桿菌屬成為最大的優勢菌，為66.02%，現已有眾多報道證明，乳酸桿菌屬為發酵中主導菌系[19-20]，其次為克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬，分別為17.36%和10.2%。發酵到第12天，乳酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬為優勢菌種，分別為30.83%、25.39%和31.34%。發酵到第15天，乳酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬為優勢菌種，分別為43.81%、14.44%和34.34%。紅糟酸成品中，乳酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和伯克霍爾德菌屬為優勢菌種，分別為32.27%、24.25%和35.25%。在屬水平上，紅糟酸過程樣真菌優勢菌均為紅曲霉。發酵中期，念珠球菌隨發酵時間的延長有所增加，但占比較小。由上述研究可知，伯克霍爾德菌屬和克雷伯氏菌屬在發酵過程中占絕對優勢，未分類菌屬在發酵前期占優勢，乳酸菌在發酵后期占絕對優勢。

圖5 屬水平過程樣群落結構

在泡菜發酵過程中，會產生一些與發酵無關的菌，甚至是有害菌。在紅糟酸中存在伯克霍爾德菌、克雷伯氏菌、大腸桿菌(E.coli)、阪崎腸桿菌、黃單胞桿菌、類芽孢桿菌等有害菌，大腸桿菌是常見的腸道菌，也是食品中常用的糞源性污染衛生細菌學指標[21]，該菌耐高溫，55 ℃下可存活60 min且其最適pH為7.2～7.4，大腸桿菌在紅曲米中限量為3.0 MPN/100 g，因此該菌是威脅紅糟酸安全的微生物。此產生的原因可能與制作過程中操作環境、工作人員衛生規范以及原料有關。據觀察，紅糟酸制作過程中環境雖較干凈，但并未做到完全無菌，加上在對紅曲米制作工藝考察中發現，紅曲米制作過程中使用自來水洗米，發酵晾曬環境也沒有做到無菌，都可能是導致在樣品中檢測出大腸桿菌的原因。因此，在整個制作過程中要嚴格把控原材料以及操作人員的衛生健康問題，對直接接觸食品的水要進行殺菌。

由圖6可知，紅糟酸發酵前期，伯克霍爾德菌屬、駒形桿菌屬、類芽孢桿菌屬呈增加趨勢，達到峰值后逐漸下降。片球菌屬在發酵前期占比幾乎為零，在發酵達到峰值后逐漸下降，乳酸桿菌屬和片球菌屬均屬于乳酸菌的范疇[22]。醋酸菌屬、大腸桿菌在發酵初期略有增加后一直呈下降趨勢。克雷伯氏菌屬、黃單胞桿菌屬、不動桿菌屬、克羅諾桿菌屬、弗朗克氏桿屬在種子中占比較大，之后呈大幅度下降趨勢，在下降過程中有小幅度波動。乳酸桿菌屬、桿菌屬在發酵前中期占比上升至峰值后下降。

圖6 紅糟酸發酵過程微生物變化

在真菌中，紅曲霉在種子中占比最高，在發酵中期緩慢下降至最低并隨著發酵時間的延長逐漸上升，酵母菌的變化規律與紅曲霉相反。Diutina，Cyberlindnera，unclassified，Pseudallescheria占比在發酵后期無增加后下降。畢赤酵母菌占比在發酵前期增加至峰值后下降。念珠菌屬、Dekkera的占比在發酵前中期上升至峰值后下降。Kregervanrija、曲霉菌在種子中占比最高，隨著發酵過程的進行占比幾乎為零。

2.4 發酵過程樣與成品中優勢微生物群落分析

由圖7可知，過程樣與成品樣對比發現，克雷伯氏菌屬、紅曲霉、畢赤酵母菌和念珠菌屬貫穿整個發酵過程，在成品中均存在，而未分類菌和Diutina只在發酵中存在，在成品中未見到，成品中的優勢菌增加了醋酸桿菌屬和片球菌屬。現有關紅糟酸的報道較少，但在泡菜和發酵食品相關的研究中，均發現了與紅糟酸相同的優勢菌屬。金華等[23]基于MiSeq高通量測序技術，發現自然發酵蔬菜片球菌屬和乳酸桿菌屬為主要優勢菌屬，最高占比為59.59%。寧明等[24]對不同地區辣椒醬進行細菌多樣性分析，發現乳酸桿菌屬和醋酸桿菌屬等為主要的優勢菌屬。這些優勢菌屬對發酵食品的風味及品質有一定的影響，但對紅糟酸的風味和品質是否有影響還需進行進一步的探究。

圖7 樣品優勢菌群落結構

3 討論與展望

本文對來自廣西來賓市武宣縣不同村莊的紅糟酸進行微生物群落多樣性分析，其中，伯克霍爾德菌和克雷伯氏菌在發酵過程中占比較大，醋酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和片球菌屬在成品中占比較大。紅曲霉菌是樣本中真菌優勢菌且抑制了酵母菌的生長。在紅糟酸發酵過程中，發現了一些非發酵菌和致病菌，這提示在紅糟酸制品中存在微生物安全性問題，應將使用無菌水，原料清洗晾曬這一環節改為無菌操作，在灌裝前增加乳酸桿菌屬添加步驟。

紅糟酸的發酵與復雜的微生物區系相關，微生物種類和區系結構對紅曲制品的產量、質量和風味起著至關重要的作用。本文為進一步對紅糟酸安全性評價的研究提供了理論基礎，為日后紅糟酸制作中微生物病害控制提供了積極的參考意見。