青藤堿治療類風濕性關節(jié)炎免疫作用和機制

宋良月 張 榕 張散羊

（沈陽市第四人民醫(yī)院老年醫(yī)學中心，遼寧 沈陽 110034）

類風濕性關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種嚴重的自身免疫性疾病。流行病學研究顯示，全球發(fā)病率為1%～2%，而我國的發(fā)病率為0.32%～0.36%[1]。由于該疾病的致殘率較高因此給家庭和社會帶來沉重的負擔。2002年美國風濕病學會發(fā)布的RA治療指南中指出，對于RA的治療原則為控制疾病發(fā)展，緩解疼痛干擾，即抑制骨滑膜炎這、防止和控制關節(jié)破壞，組織功能喪失并減輕疼痛程度。目前治療RA的主要藥物為非甾體抗炎藥等以及氨甲蝶呤等藥物，但療效及安全性均不理想。青藤堿是從青藤中提取出來的生物堿單體，相關研究顯示，青藤堿可以降低小鼠脾臟和胸腺質(zhì)量，對巨噬細胞的吞噬功能具有抑制作用，還可以抑制人體的細胞免疫。臨床研究數(shù)據(jù)顯示青藤堿治療RA的總有效率可達到85%[2]，但是治療機制目前尚未清晰，根據(jù)以上情況本次重點探討青藤堿治療RA的免疫抑制作用及機制。

1 資料與方法

1.1 動物模型及材料 SD大鼠；按照2 mg/mL將牛Ⅱ型膠原蛋白加入0.1 mol/L的冰醋酸中，在4 ℃中過夜，臨近使用前加入等體積的不完全弗式佐劑，使用組織勻漿機進行充分的銳化，并滴入水中呈水滴狀，得到1 mg/mL的膠原乳劑，即刻即用。大鼠的造模方法為在鼠尾根部2～3 cm處皮下注射乳膠原蛋白乳化劑，在第7天激活免疫，正常對照組以等量生理鹽水進行注射。選擇我院風濕免疫科確診為類風濕關節(jié)炎患者，并實行關節(jié)置換術，選取其人類風濕滑膜。

1.2 試劑來源 選取湖南正清制藥公司生產(chǎn)的青藤堿，體內(nèi)試驗以DMSO助溶，生理鹽水配置后保存（溫度為4 ℃）。體外試驗為藥物以DMSO助溶，再以不完全培養(yǎng)基配成10 mmo/L母液，微孔濾膜過濾除菌，臨用前使用不完全RPMI1640稀釋成所需的濃度。ConA、LPS、PMA購自于Sigma公司，凋亡試劑盒購自于寶賽生物公司。取血為在給藥次日大鼠腹部主動脈取血，在4 ℃靜置1 h后，在3 000 r離心機中離心15 min，取血清，在-20 ℃中保存，以備用。

1.3 方法

1.3.1 淋巴增殖試驗 常規(guī)制備大鼠淋巴細胞，調(diào)整細胞數(shù)至5×106/mL，加入刺激劑和不同濃度的試驗動物于37 ℃ 5%CO2孵化箱中孵化72 h，以MTT法測定細胞增殖情況。體外試驗中先以不同濃度的藥物進行肌內(nèi)注射，注射7 d后取脾淋巴細胞，調(diào)整細胞參數(shù)5×106/mL，加入刺激劑，在37 ℃ 5%CO2孵化箱中孵化72 h，以MTT培養(yǎng)測定細胞增殖情況。

1.3.2 原代類風濕關節(jié)炎滑膜細胞培養(yǎng) 將RA患者的滑膜組織充分剪碎，加入溶于DMRM的膠原蛋白中，加入37 ℃，50%的CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)消化，加入0.2%的胰蛋白酶然后再100目篩中過濾。0.2%胰蛋白酶-0.02% EDTA-Na2重懸細胞，然后靜置10 min，含10%小牛血清DMEM洗滌并重懸細胞，細胞數(shù)量為1×106/mL。以上培養(yǎng)2 h后將未貼壁的細胞轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，吸棄未貼壁的細胞，然后4～6 h后細胞生長至融合期，使用2%的胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2進行消化，按照1∶3進行傳代，3代之后進行檢測。

1.3.3 IL-1β、IL-17和血清TNF-α水平值 測定方法采取ELSA法，工作液在使用前前15 min配置：設置空白組（空白組不嫁樣品以及酶標試劑，其余操作步驟相同）、標準品孔、待測樣品孔。在酶標包被上標準品孔加入稀釋的標準品50 μL，酶標包被板上待測樣品孔先加入樣品稀釋至40 μL，然后再加待測樣品10 μL，混勻后孵化30 min（37 ℃）。丟棄液體，甩干，每個孔加滿稀釋液后洗滌，震蕩30 s后甩去洗滌液，用吸水紙吸干，重復5次。每個孔酶標試劑50 μL，空白除外，晃動后孵化30 min（37 ℃），丟棄液體，甩干，每個孔加滿稀釋液后洗滌，震蕩30 s后甩去洗滌液，用吸水紙吸干，重復5次。每個孔加入試劑A50 μL，再加入顯色劑B50 μL，震蕩后避光顯色10 min（37 ℃）。取出酶標板每個孔加入終止液50 μL，終止反應。然后以空白孔凋零，測量各個孔的吸光度值（在450 nm波長下測定），測定時在加入終止液15 min內(nèi)進行，然后計算濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析 相關數(shù)據(jù)那人統(tǒng)計分析血SPSS20.0中分析，t檢驗分析計量資料，χ2檢驗分析計數(shù)資料，檢驗標準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 青藤堿離體對小鼠淋巴細胞增生反應影響 離體淋巴細胞增殖試驗顯示，SIN對ConA、LPs和anti-CD3誘導的脾淋巴細胞可顯著抑制其增殖，但是不能抑制于PMA誘導的脾淋巴細胞。見表1。

表1 青藤堿對離體對小鼠淋巴細胞增生反應影響

2.2 青藤堿對人類風濕免疫關節(jié)炎滑膜細胞增殖影響 對于類風濕關節(jié)炎患者的滑膜細胞，在濃度為0.01～1.00 mmol/L范圍內(nèi)青藤堿可產(chǎn)生明顯抑制作用。見表2。

表2 青藤堿對人類風濕免疫關節(jié)炎滑膜細胞增殖影響（%，）

表2 青藤堿對人類風濕免疫關節(jié)炎滑膜細胞增殖影響（%，）

注：a表示與控制組比較P＜0.05。

2.3 IL-1β、IL-17和血清TNF-α水平值影響 正常組的IL-1β值為（29.60±1.50）pg/mL，SIN組為（47.50±2.50）pg/mL，差異明顯（P＜0.05）；正常組的IL-17值為（45.20±1.10）pg/mL，SIN組為（105.20±2.20）pg/mL，差異明顯（P＜0.05）；正常組的TNF-α值為（11.00±0.20）pg/mL，SIN組為（52.30±0.70）pg/mL，差異明顯（P＜0.05）。

3 討 論

RA通常病理表現(xiàn)為炎癥滑膜增生、有新血管形成或者呈現(xiàn)單核細胞浸潤性。，其形成原因為，由于其特征類似于侵蝕性生長的腫瘤，所以治療難度極大[3-4]。相關學者研究發(fā)現(xiàn)[5]，HLA與RA的發(fā)病密切相關，3/4的RA患者在T細胞受體的抗原結(jié)合區(qū)域攜帶Ⅱ的MHC分子，并且T細胞攜帶有可被以上物質(zhì)激活的因子，因此T細胞的活化在RA的疾病發(fā)生和發(fā)展過程中具有重要的作用。

臨床研究顯示，青藤堿具有較多的壓藥理作用比如抗癌、神經(jīng)炎性疾病治療以及抑制成熟破骨細胞增生和抗血管增生等[6-8]。青藤堿能夠抑制過氧化氫誘導的乳鼠心肌細胞的凋亡，抑制血管平滑肌細胞的表型轉(zhuǎn)換，因此治療血管增生療效顯著[9]。在本次的臨床研究中，青藤堿能夠抑制小鼠T淋巴細胞的增生，對ConA、LPs和anti-CD3誘導的脾淋巴細胞增殖有顯著的抑制作用，此外對于濃度為0.01～1.00 mmol/L范圍內(nèi)SIN具有抑制RA滑膜細胞的增殖，以此說明青藤堿對于類風濕性關節(jié)炎具有良好的治療作用，治療機制也顯著，結(jié)果與前人報道基本一致[10]。總之，經(jīng)本次研究筆者認為：青藤堿對于RA和脾淋巴細胞具有免疫抑制作用，而誘導細胞的凋亡可能為免疫作用機制的一種。