大盤雞炒燉加工過程中蛋白質降解和微觀結構變化

趙電波 栗俊廣 柳紅莉 白艷紅

(1. 鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450001；2. 河南省冷鏈食品質量與安全控制重點實驗室，河南 鄭州 450001；3. 大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034)

雞肉蛋白富含人體必需氨基酸，且種類齊全、比例均衡，具有較高的營養價值。肉與肉制品中的蛋白質不僅是主要營養物質的來源，也是形成產品品質(質構、風味和色澤)的物質基礎。經加熱處理后，肌肉蛋白質發生降解，產生一系列多肽、短肽、游離氨基酸、核苷酸、核苷等風味物質[1]。目前中國對于傳統雞肉制品的研究主要集中于加工方式的改進[2-3]、產品品質的改善[4-5]、貯藏與保鮮[6]、加工過程中有害物質的控制[7]、揮發性風味物質的成分分析及風味、滋味的呈現與保持[8]。有研究[9]表明，肌肉中蛋白質的降解、非蛋白氮(non-protein nitrogen，NPN)和游離氨基酸含量的變化對風味的形成具有重要作用。

大盤雞是具代表性的中華傳統炒制類雞肉菜肴，以其獨特的風味和良好的營養價值享譽海內外，深受消費者喜愛[5]。傳統的大盤雞制作方法是先炒制再燉炒，具有色澤鮮艷、爽滑麻辣、味道鮮美的特點。然而，以手工制作為主的大盤雞，機械化程度低，沒有形成標準化、工業化產品，市場流通量較小，產品附加值低。目前，智能烹飪已進入快速發展階段，研究[5]表明，采用智能炒制方式制作的大盤雞與傳統手工制作在感官品質和質構方面無顯著差異，但智能炒制方式能更好地保持大盤雞的風味。研究擬采用智能炒制機模擬傳統大盤雞炒燉工藝，以制作大盤雞的原料肉、炒制后的半成品和燉炒后的成品為研究對象，測定不同加工工序樣品中游離氨基酸、不同氮含量并分析蛋白降解和微觀結構的變化，以期為大盤雞的工藝改進及工業化標準化生產提供指導或技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃羽肉雞冷鮮雞脯肉：屠宰后24～48 h，市售；

大豆油、精制鹽、白砂糖、花椒、八角、干紅椒、大蔥、生姜：鄭州市某大型超市；

化學試劑均為常用分析純；

智能炒制機：鄭州輕工業大學試制；

氨基酸自動分析儀：835-50型，日本日立公司；

半自動凱氏定氮儀：K9840型，中國海能公司；

高速分散器：XHF-D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷凍離心機：TGL-20KR型，上海安亭科學儀器廠；

數顯恒溫水浴鍋：HH.S4型，金壇市醫療器械廠；

真空冷凍干燥機：Lab-1-50型，北京博醫康實驗儀器有限公司；

掃描電子顯微鏡：JSM-7001F型，日本JEOL公司。

1.2 方法

1.2.1 原料肉的處理及樣品制備 將黃羽肉雞冷鮮雞脯肉經凈水清洗后，分割成長×寬×厚約為3.5 cm×3.5 cm×3.5 cm的雞塊，待用。結合前期感官評價結果，原料及調味料配比：原料肉100 g、大豆油6 g、白砂糖3 g、生姜1.5 g、花椒0.4 g、八角0.2 g、干辣椒1.2 g、鹽1.4 g、水21 g、大蔥段8 g。

智能炒制：智能炒制機預熱后，依次按上述配比加入大豆油、白砂糖、雞肉，炒制6 min；再加入生姜、花椒、八角、干辣椒、食鹽、大蔥段和水，燉炒10 min后，成品出鍋。

1.2.2 樣品采集 在原料肉、炒制后、燉炒后(成品)3個關鍵工序處取樣，撈出雞脯肉塊，除去表面雜物，吸水紙吸掉表面湯汁，冷卻至室溫，待測。

1.2.3 氨基酸的測定 采用氨基酸分析儀[10]，試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.4 蛋白質水解指數(PI)的測定

(1)總氮(TN)含量測定：采用凱氏定氮法[11]。

(2)非蛋白氮(NPN)含量測定：參照鄒良亮等[12]的方法并作適當修改，取3 g左右(精確到0.001 g)樣品，加入25 mL 體積分數為10%的三氯乙酸溶液，冰水浴高速勻漿(10 000 r/min)，每次18 s，勻漿3次，4 ℃條件下靜置12 h；于10 000 r/min條件下冷凍離心15 min，取上清液過濾并定容至25 mL，取2 mL進行消化用凱氏定氮法測定NPN含量。

(3)蛋白質水解指數(PI)計算：參照鄒良亮等[12]的方法，按式(1)計算蛋白水解指數。

I=ωNPN/ωTN×100%，

(1)

式中：

I——蛋白水解指數，%；

ωNPN——非蛋白氮含量，g/100 g；

ωTN——總氮含量，g/100 g。

1.2.5 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳分析

(1)肌原纖維蛋白提取：參考Zhao等[13]的方法，并稍作修改。雞胸肉剔除可見結締組織和多余脂肪，切成l～2 cm小塊并絞碎；在0～4 ℃下將均勻絞碎的雞胸肉(150～180 g)與分離緩沖液(10 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4，0.1 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，pH 7.0，4 ℃)按m雞胸肉∶V緩沖液=1∶4 (g/mL)混合，高速分散器(10 000 r/min)中勻漿3次，每次30 s；所得肉漿用20目過濾網(孔徑0.9 mm)過濾得濾液，4 127 r/min離心15 min，收集沉淀得到粗肌原纖維蛋白沉淀。將此肌原纖維蛋白沉淀分散在提取液(0.1 mol/L NaCl)中[m沉淀∶V提取液=1∶4 (g/mL)]，低速勻漿30 s(2 000 r/min)，4 127 r/min 離心15 min，重復相同步驟兩次，得到純化的肌原纖維蛋白放入碎冰屑中并置于4 ℃貯藏備用。

(2)電泳條件：參照Wang等[14]的方法，并稍作修改。將純化的肌原纖維蛋白溶于濃度為0.6 mol/L的NaCl溶液中，采用雙縮脲法測定并調整蛋白質濃度為10 mg/mL，分離膠為12.0%，濃縮膠為5.0%，濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓調整為110 V；電泳完成后，取出膠片在R-250染色液中染色30 min后，雙蒸水沖洗，脫色液(甲醇—冰醋酸—雙蒸水混合液，其中V甲醇∶V冰醋酸∶V雙蒸水=100∶35∶365)中過夜脫色備用。

1.2.6 微觀結構分析 參照Zhao等[13]和李可等[15]的方法，并稍作修改。將樣品順著肌原纖維方向切成長×寬×厚約為2 cm × 1 cm × 1 cm的肉塊后，置于-85 ℃ 超低溫冰箱中冷凍2 h后，再置于冷凍干燥機中干燥5 h，制成厚約0.1 cm的肉片并粘臺，最后置于離子濺射裝置中噴鉑金，采用掃描電子顯微鏡觀察其微觀結構并拍照。

1.2.7 數據處理與分析 試驗重復3次，采用Excel 2010進行數據統計，氨基酸含量取3次平均值；TN和NPN含量采用SPSS 17.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗，當P<0.05時判定不同處理組之間存在顯著差異。

2 結果與分析

2.1 游離氨基酸變化

由表1可知，雞肉經炒制和燉炒加工后，所能檢測到的氨基酸含量均呈上升趨勢。炒制后的半成品和燉炒后的成品中的游離氨基酸含量分別為27.60，30.38 g/100 g，分別比原料肉增加了35.03%，48.63%。戚巍威等[16]研究認為，游離氨基酸的增加和減少取決于其形成量和降解量的比值，大盤雞中游離氨基酸含量在炒制和燉炒階段均高于原料肉。這可能是由于加熱處理，使肌肉蛋白在氨肽酶的作用下發生降解生成游離氨基酸，導致其含量增加[17]4。

原料肉游離氨基酸中含量最高的是谷氨酸，為3.32 g/100 g，占所能檢測到總氨基酸含量的16.24%，其次是賴氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、精氨酸和丙氨酸；大盤雞燉炒后的成品中含量最高的也是谷氨酸，高達5.02 g/100 g，占所能檢測到總氨基酸含量的16.52%，其次是天冬氨酸、賴氨酸、亮氨酸、精氨酸和丙氨酸。

谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸6種氨基酸是重要的呈味氨基酸[18]。試驗原料肉中這6種呈味氨基酸含量為8.82 g/100 g，占所能檢測到總氨基酸含量的43.15%；炒制后的半成品和燉炒后的成品中這6種呈味氨基酸含量分別為12.39，13.74 g/100 g，與原料肉相比，分別增加了40.48%，55.78%。這是由于加工烹飪過程中，雞肉蛋白受熱降解生成呈味游離氨基酸。

表1 大盤雞加工過程中的氨基酸含量、滋味閾值及滋味特征?Table 1 The contents of amino acids,taste thresholds and characteristics of Dapanji during processing

炒制后的半成品和燉炒后的成品與原料肉相比，必需氨基酸含量分別增加了40.24%，53.78%；燉炒后的成品中必需氨基酸含量占所能檢測到總氨基酸含量的45.23%，高于聯合國糧農組織/世界衛生組織(FAO/WHO)推薦的成人理想氨基酸模式(36%)[18]。說明炒制和燉炒有利于大盤雞營養價值的提升。燉炒后的成品中疏水性氨基酸(丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)比原料肉和炒制后的半成品分別增加了56.17%，9.85%，表明疏水性氨基酸在炒制階段被優先釋放出來，含量增加較多。

作為滋味物質，游離氨基酸不僅具有甜、咸、酸、鮮等多種味道，還可與還原糖發生美拉德反應形成己醛、壬醛、庚醛等醛類物質，或通過Strecker降解形成一些脂類、醇類和酮類物質，而這些物質會進一步與脂類氧化產物進行反應，形成大盤雞的特有滋味。由表1可知，大盤雞成品中的各種游離氨基酸含量均高于其滋味閾值，尤其是鮮味氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的含量分別是其閾值的167倍和98倍，這可能是提升大盤雞風味的一個原因。

2.2 含氮物質及蛋白水解指數變化

TN含量、NPN含量及PI的變化可以客觀地反映大盤雞在加工過程中蛋白質的降解。由表2可知，原料肉經炒制后，TN含量有所增加，但不顯著(P>0.05)，可能是由于炒制過程中的高溫使雞肉中的水分部分損失，導致TN含量相對增加；在燉炒階段，水和食鹽的加入促使部分鹽溶性成分和水溶性含氮物質溶出到大盤雞湯汁中，再者，炒制階段產生的游離氨基酸、肽類等與脂肪水解所產生的各種脂肪酸發生反應產生了部分揮發性的含氮物質，造成燉炒后的成品中TN含量比原料肉顯著降低(P<0.05)。

NPN是蛋白質發生降解的重要產物之一，主要包括除蛋白質以外的多肽、短肽、游離氨基酸、核苷酸、核苷等，也是表征蛋白降解的重要指標，其含量的變化會影響肉制品的品質。有研究[9]表明，蛋白質中降解程度最大的兩種組織蛋白為肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，這兩種組織蛋白降解產生的NPN等成分對肉制品的品質有重要影響。由表2可知，炒制后的半成品NPN含量比原料肉有所增加(P>0.05)，主要是因為炒制時的高溫使雞肉蛋白發生降解，產生多肽、短肽、游離氨基酸、核苷酸、核苷等。炒制后的半成品繼續加入食鹽和水進行燉炒，而燉炒后的成品中NPN含量比原料肉和炒制后的半成品均顯著降低(P<0.05)，可能是由于食鹽抑制了肌肉蛋白質的降解，以及一些水溶性氨基酸和肽類分子轉移到大盤雞湯汁中。有研究[19-21]表明，食鹽的添加會影響肌肉蛋白降解，且隨著食鹽添加量的增加，蛋白降解逐漸減弱，當食鹽添加過多時，會完全抑制蛋白降解。這與試驗結果一致。

表2大盤雞炒燉加工過程中TN、NPN含量及PI的變化?
Table 2 Changes of total nitrogen,non-protein nitrogen contents and proteolysis index of Dapanji during the processing of stir-fried and stewed

樣品TN含量/(10-2g·g-1)NPN含量/(10-2g·g-1)PI原料肉 3.522±0.185a0.203±0.007a5.8炒制后的半成品3.552±0.140a0.210±0.009a5.9燉炒后的成品 3.158±0.162b0.189±0.007b6.0

在大盤雞整個加工過程中，PI呈上升趨勢，說明在炒制和燉炒加工階段，雞肉蛋白發生了降解。PI的變化與游離氨基酸的變化相一致，表明燉炒后的成品中，游離氨基酸含量要高于炒制后的半成品。

2.3 肌原纖維蛋白SDS-PAGE電泳分析

由圖1可以看出，原料肉中分子量>97 kDa的肌原纖維蛋白片段經炒制和燉炒后發生了部分降解；而由炒制后的半成品到燉炒后的成品，該蛋白降解不明顯。原料肉中分子量為97 kDa的肌原纖維碎片和15～25 kDa的蛋白譜帶(肌球蛋白輕鏈)顏色變淡、條帶變窄甚至消失，表明大盤雞炒燉加工過程中肌球蛋白發生了降解，其中炒制階段發生了部分降解，燉炒階段降解程度進一步加深，部分降解產生的小分子蛋白碎片未在電泳譜帶呈現，可能是由于小分子蛋白碎片的分子量比較小，在電泳結束時已經跑出電泳譜帶。雞肉經炒燉加工后，分子量在29～37 kDa的蛋白譜帶增多，可能是因為肌球蛋白受熱變性，導致肌鈣蛋白T脫落。有研究[22]認為，30 kDa左右的片段是肌鈣蛋白T降解的特征產物。34，37 kDa肌聯蛋白經炒制和燉炒后仍然存在于樣品中且基本未發生降解，且在炒制和燉炒階段無顯著變化，由此可知，34，37 kDa肌聯蛋白屬于熱穩定蛋白，與常亞楠[17]5，32的研究結論一致。原料肉中的G-肌動蛋白(43 kDa)，經炒制后電泳譜帶顏色變淡、條帶變窄，表明G-肌動蛋白經高溫炒制后發生部分降解；炒制后的半成品繼續燉炒至成品，G-肌動蛋白降解未發生顯著變化，表明G-肌動蛋白具有較好的熱穩定性，僅次于肌聯蛋白。

由圖1還可以看出，與原料肉電泳譜帶相比，在炒制后的半成品和燉炒后的成品中，出現了47，55，60 kDa的肌原纖維蛋白譜帶，可能是因為原料肉經高溫炒制后肌球蛋白重鏈發生了降解。王振宇等[23]研究表明，當豬肉中心溫度超過60 ℃時，190～200 kDa肌球蛋白重鏈開始降解并出現大量47 kDa和部分60 kDa的蛋白降解產物。Huang等[24]研究發現，豬肉肌原纖維蛋白中分子量約為220 kDa的肌球蛋白重鏈在溫度升至100 ℃時降解顯著并出現分子量約為47～60 kDa的蛋白降解產物。

2.4 微觀結構變化

由圖2可以看出，在大盤雞炒燉加工過程中，雞肉的肌纖維結構和肌膜發生了顯著變化。與原料肉相比，炒制過程中原料由于受熱而收縮，肌膜與肌纖維相分離，肌纖維間縫隙變大，導致肌纖維組織結構開始變得緊實，形狀呈不規則多邊形，大小不均一；在燉炒階段，水的加入使雞肉表面溫度降低，隨著燉炒時間的延長，雞肉的中心溫度逐漸升高，肌肉內部肌原纖維蛋白受熱聚集、收縮[25]；張立彥等[26]研究表明，當中心溫度達95 ℃時三黃雞雞肉中肌內膜和肌束膜發生崩解、膠原蛋白凝膠化而導致相鄰肌纖維彼此排列變得緊實、致密。因此，燉炒后的大盤雞成品肌膜溶解，肌纖維組織結構緊實，形狀呈規則多邊形，大小基本一致，肌纖維間緊密排列。

M.標準蛋白 A.原料肉 B.炒制后的半成品 C.燉炒后的成品圖1 大盤雞炒燉加工過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE圖

圖2 大盤雞炒燉加工過程中掃描電鏡微觀結構圖Figure 2 SEM of Dapanji during the processing of stir-fried and stewed

3 結論

采用智能炒制機炒制后的大盤雞半成品中游離氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量比原料肉中的相應值分別增加了35.03%，40.24%，40.48%；經燉炒加工后的大盤雞成品中游離氨基酸、必需氨基酸和呈味氨基酸的含量分別比原料肉中的相應值分別增加了48.63%，53.78%，55.78%；經過燉炒工藝可以增加蛋白降解程度。因此，大盤雞制作過程中燉炒工藝有助于增加大盤雞的營養價值和提升其滋味并改善產品口感。由于試驗要測定氨基酸含量的變化，未添加老抽和味精等含有氨基酸的調味料。為了保持大盤雞的原有滋味和風味，后續將進一步研究調味料對產品中氨基酸的貢獻。