國產人工視網膜視覺假體植入兔眼的短期安全性和穩定性的研究

張赟 陳亦棋 陶繼偉 佘相均 董玉桂 沈麗君

視網膜退行性病變是導致視力喪失的主要原因之一，包括年齡相關性黃斑變性和視網膜色素變性，均可造成外層光感受器細胞的破壞，這些損傷的細胞不能傳遞信號至內層視網膜，導致視功能下降，甚至失明[1-2]。目前尚無有效的方法挽救損傷的視細胞，基因治療也僅用于RPE65突變的患者[3]，干細胞治療遇到的成瘤性還有待解決[4]。視覺假體的發展可以避開損傷的光感受器細胞，直接刺激內層視網膜，將視覺信息轉化為電信號，產生人工視覺，經過前期的臨床實驗證實，其具有一定的安全性，并能有效提高患者的視功能[5-6]。

人工視網膜視覺假體主要包括視網膜前假體、視網膜下及脈絡膜上腔假體，其中視網膜前假體因具有手術操作空間大、容易散熱的優點而被廣泛應用[7]。通過長期的臨床觀察，商用的ArgusⅡ視覺假體能有效改善患者的生活視覺質量，具有廣泛的臨床應用前景[8]。目前，國外已上市的產品價格昂貴，且無法運用于我國患者，而國內尚無上市的人工視網膜視覺假體產品。本研究擬評估國產人工視網膜視覺假體在兔眼植入后的短期安全性和穩定性，并為其設計、技術改良及臨床實驗打下基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 人工視網膜視覺假體試驗樣品，型號規格：VS-10A；人工視網膜視覺信號處理器，型號規格：NVP-60A，由浙江諾爾康神經電子科技股份有限公司提供。

1.2 實驗動物 成年健康白毛黑眼兔10只，雌雄兼用（雌性未產并無孕），右眼為實驗眼，購自新昌縣大市聚鎮欣健兔場，生產許可證：SCXK（浙）2015-0004。飼養于浙江省醫療器械檢驗院動物中心，普通環境，使用許可證號：SYXK（浙）2014-0016。適應環境時間為5 d。符合GB/T 16886.2《醫療器械生物學評價 第2部分動物福利要求》的規定及其他實驗動物福利的相關要求，操作均嚴格遵守《實驗動物管理條例》的相關規定。排除標準：排除有眼球發育異常、視網膜脫離、白內障、視神經發育不良等眼部疾病的兔子。

1.3 手術器械 所有手術均在浙江省醫療器械檢驗院動物中心完成，手術機器為玻璃體切除及超聲乳化吸除一體機（型號：Constellation，美國愛爾康公司）。

1.4 手術植入步驟

1.4.1 術前準備 當日頻點氧氟沙星眼藥水（日本參天制藥株式會社能登工廠，規格：5 ml∶24.4 mg，國藥準字：J20100046）于術眼。術前復方托比卡胺滴眼液[參天制藥（中國）有限公司，規格：5 ml∶托吡卡胺25 mg，鹽酸去氧腎上腺素25 mg，國藥準字：H20063360]散瞳、麻醉，全身麻醉后側臥位放置于手術臺上，手術眼與手術臺呈水平狀。準備人工視網膜生物阻抗監測儀（浙江諾爾康神經電子科技股份有限公司），準備手術。

1.4.2 手術過程

1.4.2.1 背部接收器植入 沿背部正中切開皮膚，鈍性分離兩側皮膚及皮下組織，接收器植入皮下。背部接收器植入示意見圖1。

圖1 背部接收器植入示意圖（a：沿背部皮膚正中切開皮膚；b：接收器；c：將接收器植入皮下）

1.4.2.2 導線準備 術眼沿角膜緣360°打開球結膜及筋膜，往上穹窿方向分離眶皮膚，至眉弓，過耳前與背部皮下隧道相連。將背部皮下的接收器導線及電極芯片用保護鉗夾取，從隧道內引入眶內結膜下，導線從直肌下環繞眼球至電極芯片擬植入切口部位；10-0縫線固定導線于眼球壁，縫合背部皮膚。導線準備步驟見圖2。

圖2 導線準備步驟示意圖（a：沿角膜緣360°打開球結膜及筋膜；b：背部皮下的接收器導線及電極芯片用保護鉗夾取，從隧道內引入眶內結膜下，導線從直肌下環繞眼球至電極芯片擬植入切口部位；c：10-0縫線固定導線于眼球壁，縫合背部皮膚）

1.4.2.3 人工視網膜視覺假體芯片植入 切除術眼晶狀體及玻璃體；于植入部位角膜緣后1.5 mm處行鞏膜切口，電極植入鑷將電極芯片送入玻璃體腔內至后極部，視網膜釘將電極芯片固定；切口縫合并用異體兔鞏膜補片覆蓋，密閉縫合；縫合手術切口，縫合結膜組織。將人工視網膜視覺假體體外機與植入體連接，測量植入體電極阻抗和通斷情況，人工視網膜視覺假體芯片植入步驟見圖3。

圖3 人工視網膜視覺假體芯片植入步驟示意圖（a：植入背部接收器；b：玻璃體切除；c：晶狀體切除；d：人工視網膜視覺假體芯片植入；e：異體兔鞏膜補片）

1.4.3 術后護理 碘伏消毒皮膚切口1周；40萬U青霉素肌肉注射預防術后感染；左氧氟沙星眼藥水（可樂必妥）4次/d，滴眼1個月；妥布霉素地塞米松滴眼液4次/d，滴眼1個月；妥布霉素地塞米松眼膏每晚1次，涂眼1個月。傷口愈合后每天將體外機與植入體連接，并開機刺激2 h，連續刺激2個月。

1.5 觀察指標

1.5.1 術中觀察指標 包括角膜是否透明、視網膜脫離、前房出血、眼內出血、人工視網膜視覺假體電極芯片的位置。

1.5.2 術后觀察指標 分別于術后 1、7 d，1、3、6個月觀察角膜是否透明、前房出血與術后并發癥發生情況（如眼內出血、視網膜脫離、眼內炎癥情況）。若眼屈光介質清晰則利用光學相干斷層成像術（optical coherence tomography,OCT）（科林儀器股份有限公司），眼底照相（OPTOMED SMARTSCOPE VET2）及B超（法國光太AVISO眼科AB超）檢查評估人工視網膜視覺假體電極芯片與視網膜的位置。

1.5.3 病理學觀察 采用HE染色。植入術后6個月時，空氣栓塞處死動物，摘取眼球后置于新鮮配制的10%甲醛固定2 d，將眼球從正中剪成兩半，去除晶狀體和玻璃體，小心取出視網膜釘，放入塑料包埋盒里，制作成石蠟塊并在視網膜釘處進行切片，厚度為5 μm，將玻片放入烘箱（設為70℃）烤2 h，分別置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ液體各10 min，并用無水乙醇洗去二甲苯，洗去后將樣本玻片依次浸入100%、95%、70%、30%乙醇各2 min，然后置于溫水鍋（37～38℃）煮2 min進行脫蠟。將玻片用蒸餾水潤濕1 min，濾紙吸干水分，使用蘇木素染色1～5 min，并用PBS沖洗，再使用1%鹽酸乙醇和1%稀氨水返藍后沖洗，并使用伊紅復染，分別用95%乙醇、無水乙醇、二甲苯各處理2 min，吸取中性樹膠液滴在組織上封片，在顯微鏡下觀察視網膜形態學改變。

2 結果

2.1 人工視網膜視覺假體植入術中及術后情況 10只兔均完成人工視網膜視覺假體植入術。術中觀察角膜透明。1只兔眼術中植入電極芯片時出現視網膜裂孔及視網膜出血，玻璃體積血較為明顯；余9只兔眼無明顯出血，人工視網膜固定于視網膜表面。人工視網膜視覺假體植入術中、植入術后1 d及1個月情況見圖 4（插頁）。

圖4 人工視網膜視覺假體植入術中及術后情況（a：術中觀察角膜透明，箭頭示電極芯片；b：視覺假體植入術后1 d，角膜透明，前房氣泡，少許出血；c：植入術后1個月時眼前節照相，箭頭示人工視網膜視覺假體導線位于球結膜下）

2.2 人工視網膜視覺假體植入后安全性評估 10只兔進行植入手術后均完成了6個月的觀察，無死亡情況。1只兔眼術中出現眼內出血，術后1個月時出血吸收，可見人工視網膜視假體芯片位正，芯片附近出現視網膜脫離；余9例兔眼術后無眼內出血，人工視網膜視覺假體位于視網膜表面，無視網膜脫離，見表1。

表1 人工視網膜視覺假體植入術后安全性評估[只（%）]

2.3 人工視網膜視覺假體貼附效果 因視網膜假體接收器位于兔背部，導線經皮下穿行，繞過頸部，因此術后兔頭部活動度差，配合拍眼底照難度較大。眼底彩照顯示視網膜表面人工視網膜視覺假體貼附，可見視網膜釘，見圖5（插頁）。B超檢查顯示視網膜表面扁平樣物貼附，一端見高回聲影突向玻璃體腔（符合視網膜釘聲影），見圖6。由于兔眼配合度差OCT掃描欠清，隱約可見視網膜表面有扁平物貼附，見圖7（插頁）。

圖5 人工視網膜視覺假體植入術后眼底照相示意圖（a：眼底照相拍攝兔眼的示意圖；b：眼底照相中拍攝的人工視網膜視覺假體芯片，箭頭所指為芯片位置；c：箭頭所指為人工視網膜視覺假體的電極芯片；d：眼底彩照，箭頭所指為視網膜釘所在位置）

圖6 人工視網膜視覺假體植入術后B超檢查示意圖（a：B超檢查示意圖；b：后極部見高回聲突起，箭頭所示為人工視網膜視覺假體視網膜釘所在位置；c：人工視網膜視覺假體芯片所在位置）

圖7 人工視網膜視覺假體植入光學相干斷層成像術（OCT）檢查示意圖（a：術中OCT檢查示意圖；b：正常兔眼的視網膜OCT掃描結構，視網膜平復；c：視網膜表面見粗糙不均勻信號，為視覺假體芯片所在位置，未見視網膜脫離）

2.4 人工視網膜視覺假體植入眼內位置及病理切片評估 植入術后6個月時，摘除眼球，觀察人工視網膜視覺假體芯片所在視網膜的位置，并進行病理切片檢查，HE染色可見芯片植入附近視網膜外核層變薄，視網膜單核細胞浸潤，見圖8（插頁）。

圖8 人工視網膜視覺假體植入6個月時芯片位置及視網膜病理切片圖[a：眼球摘除去除角膜后觀察到眼底情況，箭頭所指為視覺假體位置；b：切塊眼球的縱向示意圖，箭頭所指為視網膜釘；c：病理切片示意圖，可見外核層（ONL）和內核層（LNL）細胞排列紊亂，呈空泡樣改變；RPE為視網膜色素上皮細胞；HE染色，×100]

3 討論

國產人工視網膜視覺假體放置于視網膜表面，手術中操作空間大，術后6個月的觀察結果顯示，具有良好的視網膜貼附性，對視網膜損傷小，穩定性和安全性均較好，但是依然存在術中出血，形成視網膜裂孔的風險。

視網膜前視覺假體通過直接刺激神經節細胞產生信號，而在植入過程中常常通過釘子將電極固定于視網膜上，會損傷視網膜神經節細胞，同時植入視網膜釘時需要用力尋找突破感，力的大小難以把握，容易造成視網膜出血和視網膜脫離；因此通過視網膜釘把芯片成功植入視網膜上并減少損傷和并發癥是該類技術的難點[9-11]。ArgusⅡ也是視網膜前的視覺假體，在2013年時獲得FDA的批準用于臨床實驗。最新的一項57例在視網膜色素變性患者中使用人工視網膜視覺假體的臨床研究表明，經過1年的觀察，49%患者發生了不良事件，26%患者發生了嚴重不良事件，其中9例與產品有關，4例與手術操作有關，絕大多數不良事件均能解決，在該研究中也發現2例患者發生了視網膜脫離和玻璃體出血[12]。視網膜脫離及出血是常見的并發癥，這一結論在5年的長期觀察中也被證實，但概率僅為3.3%左右[13-14]。本研究也發現了1眼視網膜脫離，并有眼內出血，這可能與手術經驗和釘子的材料有關。術中盡量控制眼壓，是減少視網膜損傷的關鍵[12]。視覺假體植入前后需要密切關注并發癥，并及時處理。

視網膜假體在體內的安全性和穩定性極為重要，本研究顯示，國產人工視網膜視覺假體植入6個月時，視網膜結構發生了紊亂，主要表現為整個視網膜的萎縮，外核層的破壞和單核細胞浸潤，提示植入體存在引起視網膜損傷的風險，然而神經節細胞的完整性是視覺假體發生功能的基礎，因此未來的研究中應該更多關注如何減少植入體對視網膜的損傷[15-16]。視覺假體植入后可能發生炎癥，在之前的臨床研究中看到，絕大多數炎癥發生在眼表，少有眼內炎的報道。本研究發現，植入體下方可以見到炎癥細胞浸潤的情況，玻璃體腔未見眼內炎，炎癥也主要表現在前節[17-18]。表明該類型的人工視網膜視覺假體短期的觀察安全性尚可，但仍需要延長時間觀察視網膜結構的損傷恢復情況，力求通過設計優化，材質改進減少對視網膜的損傷。本實驗為人工視網膜動物眼的初步安全性探索，同時在此基礎上進行了有效性的初步檢測，將體外發射線圈與皮下植入線圈耦合，發送電刺激檢測電阻抗，顯示植入體與體位設備連接正常，提示可正常工作。在此基礎上，將在以后實驗中結合視覺電生理誘發電信號分析其有效性。

綜上所述，本實驗表明國產人工視網膜視覺假體具有貼合性良好、損傷小、產品穩定等特點，具有廣泛的應用前景。但植入中造成的視網膜損傷也是亟待解決的關鍵問題，需進一步擴大樣本和延長觀察事件，證實其安全性。本研究為國產人工視網膜視覺假體的動物眼植入實驗早期探索，存在不足之處，因術后檢查設備及術后兔頸部皮下導線的影響，對術后觀察還不夠詳盡。之后將進行小型豬的國產人工視網膜視覺假體實驗，希望之后的實驗可以帶來更多的成果，從而為其設計、技術改良及臨床實驗打下基礎。