基于金屬釓-兒茶酚構建的納米影像探針在小鼠正常器官的雙模態(tài)成像

劉 杰，王玉柱

重慶北部寬仁醫(yī)院放射科，重慶401121

MRI與熒光成像（FI）相結合構建的多模態(tài)影像探針是近年來無創(chuàng)性分子成像方法的重要研究方向之一［1-3］，MRI/FI影像探針在提高單細胞敏感度和亞細胞分辨率的同時，又能實現(xiàn)較強的組織穿透力，有效彌補了兩種成像方式的不足［4-6］。既往研究已經(jīng)成功設計和評估了大量該類影像探針，如基于pH敏感或熱分解的FI-MRI雙峰成像探針［7-9］，但多存在弛豫率低、熒光發(fā)射波長較短以及穩(wěn)定性差等缺點，阻礙了該類探針的實際應用［10-12］。為解決該類探針既往研究中的不足，能夠更好應用于實際，本研究通過兩步反應制造了一種新型的MRI-FI探針：首先使用硝酸釓、單寧酸（TA）和聚乙烯吡咯烷酮分別作為金屬、配體和粘合劑，通過受控的金屬-兒茶酚配位組裝工藝合成了釓-酚類配位聚合物納米顆粒；再選擇羅丹明B（RB）作為熒光基團，與配位聚合物表面共價偶聯(lián)，構建最終的MRI-FI 雙峰探針TAGd＠RB，并進行MRI體內(nèi)和FI的體內(nèi)、外成像實驗。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料合成

雙模態(tài)含釓影像探針TA-Gd＠RB（由重慶大學生物材料學院研制），載Gd3+含量為8.2%，載RB含量為12.5%，臨床醫(yī)用DTPA-Gd購自西安瑞禧生物科技有限公司出品。TA-Gd＠RB的合成示意圖（圖1）。

圖1 TA-Gd＠RB合成示意圖Fig. 1 Synthetic schematic diagram of TA-Gd＠RB.

1.2 熒光成像

TA-Gd＠RB聚合物以20 mg/mL的濃度溶解在磷酸鹽緩沖液（PBS）中。將健康雄性KM小鼠（重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，20±2 g，8～10周）隨機分為2組（n=5），

Assembly Attach RB尾靜脈注射TA-Gd＠RB 1次（注射量20 μL，20 g/kg），PBS設為對照組。在注射后0.5、1、2、4、12和24 h在小動物超靈敏熒光成像系統(tǒng)（VISQUEIn-vivoSmart-LF,Viewers）上進行體內(nèi)以及主要器官的離體熒光成像。所有動物程序均按照《實驗動物護理和使用指南》進行，并經(jīng)重慶醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

1.3 磁共振成像

TA-Gd＠RB體外弛豫率測定在臨床1.5 T臨床磁共振掃描儀（GE SIGNA Creator）上進行。將含有不同釓濃度的TA-Gd＠RB復合溶液置于試管中進行體外進行掃描，以臨床DTPA-Gd作為對照組，通過它們的T1加權MR圖像獲取相應的1/T1值。弛豫率值（r1）是根據(jù)1/T1與Gd濃度（mmol）的曲線擬合結果的斜率計算的。

TA-Gd＠RB體內(nèi)MR成像研究選用10只健康雄性KM小鼠（20±2 g，8～10周），隨機分為2組（n=5）。使用水合氯醛（10 wt%，80 μL）麻醉動物，通過尾靜脈將50 μL TA-Gd＠RB（注射劑量400 μg/mL Gd3+）溶液一次注射到動物體內(nèi)，以臨床DTPA-Gd作為對照組，然后在不同的注射時間后進行使用臨床1.5 T磁共振掃描儀（GE SIGNA Creator）進行掃描，并獲取T1 加權冠狀MRI。成像參數(shù)如下：TR/TE=330/18.2ms，F(xiàn)OV100mm，層厚3 mm。

2 結果

2.1 MR成像

體外弛豫率圖示兩組T1圖像的亮度隨著釓離子濃度的增加而變亮，表明信號強度和濃度之間的依賴性（圖2A）。與DTPA-Gd相比，TA-Gd＠RB隨著釓離子濃度的增加，T1圖像變得更亮。隨后，將弛豫時間的倒數(shù)與釓離子濃度作圖，然后對所得曲線進行線性擬合后計算弛豫率r1。結果顯示TA-Gd＠RB的縱向弛豫率r1為6.94 mmol-1s-1，是臨床DTPA-Gd的1.7倍（r1=4.09 mmol-1s-1，圖2B）。

在體內(nèi)成像中，將TA-Gd＠RB以400 μg/mL Gd3+濃度通過尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并以臨床DTPA-Gd作為對照，在注射前和注射后1、4、8、24 h收集冠狀位T1加權圖像。結果顯示TA-Gd＠RB在1～4 h肝臟的信號逐漸增強（圖2C），最大增強幅度約110%（圖2D），8 h觀察信號強度降低；膀胱的信號8 h內(nèi)一直持續(xù)強化，24 h觀察信號強度恢復至注射前水平。而注射臨床DTPAGd后，肝臟在1 h內(nèi)強化并達到強化峰值，4 h觀察信號強度明顯降低，而膀胱信號強度則在8 h恢復至注射前水平。肝臟和膀胱的MRI增強效果和成像時間明顯不如TA-Gd＠RB（圖2E～F）。TA-Gd＠RB在肝和膀胱能達到更好的增強效果，成像窗口時間也更長。

圖2 MR成像結果Fig. 2 Results of magnetic resonance imaging.

2.2 熒光成像

在小動物活體成像系統(tǒng)上評估了小鼠的FL成像性能。對照組整只小鼠均未發(fā)現(xiàn)熒光信號（圖3A）。而實驗組在注射后0.5、1 h，能夠清晰地觀察到小鼠全身明亮的熒光，具有良好的信噪比（圖3B～G）。熒光成像信號在注射后1 h 達到峰值，然后隨著時間的增加開始下降，12 h后熒光信號變得非常微弱，24 h后在小鼠體內(nèi)完全消失。

圖3 在不同時間點靜脈注射TA-Gd＠RB的小鼠體內(nèi)熒光成像Fig. 3 In vivo fluorescence imaging of mice with intravenous injection of the TA-Gd＠RB at different time points.

然后，在不同時間點采集主要器官的離體熒光圖像，以探索TA-Gd＠RB復合材料的生物分布和排泄途徑。選擇大腦、腎臟、肝臟、心臟、胃、肺、脾臟、睪丸和腸作為解剖器官。肝、脾、胃、睪丸和腸的熒光信號總是比腦、肺、心臟和脾臟的熒光信號強得多，腦和肺的信號在3 h后消失，腎、肝、胃、睪丸和腸器官的信號在24 h后消失，這與全身熒光成像是一致的（圖4）。

圖4 在不同時間點靜脈注射TA-Gd＠RB對小鼠進行實時離體熒光成像Fig. 4 Real-time ex vivo fluorescence imaging of mice with intravenous injection of the TA-Gd＠RB at different time points.

3 討論

FI的高分辨率和MRI對穿透深度的不限制相結合，MRI/FI近年來引起了廣泛關注。精心設計和制備具有優(yōu)異生物相容性和高精度的MRI-FI成像探針對其成像性能至關重要。既往已有基于T1造影劑和熒光材料的FI-MRI雙峰成像探針的研究［13-16］。pH敏感的FIMRI雙峰成像探針是通過將輻射熒光探針和Gd-DOTA復合物連接到聚（N-（2-羥丙基）甲基丙烯酰胺）來構建的，該探針的熒光強度隨著細胞內(nèi)pH值從4變?yōu)?而變化，T1 MRI信號不受pH值變化的影響，但對T2有明顯影響［17-18］。另外一種靶向配體c（RGDyK）偶聯(lián)Gd＠C-dots是通過空氣氣氛煅燒法制備的，該探針發(fā)出強烈的藍色熒光，r1弛豫率高達5.88 mmol-1s-1，在采用一步水熱技術后，r1弛豫率可達6.27 mmol-1s-1［19-21］。通過熱分解過程，釓噴酸葡甲胺用作碳源和Gd(III)源，合成具有3～4 nm 均勻粒徑的Gd(III)摻雜碳點，該探針具有優(yōu)良的成像性能和低毒性等優(yōu)點，但體內(nèi)穩(wěn)定性較差［22-23］。而檸檬酸、乙二胺和GdCl3 也可以通過200 ℃的水熱處理制備Gd摻雜的MRI/FI雙模態(tài)探針，但量子產(chǎn)率較低［24-25］。因此，雖然既往制備了多種MRI/FI探針，但這些探針的弛豫率低，熒光發(fā)射波長較短，這些缺點阻礙了探針的實際應用。本研究合成的TA-Gd＠RB雙模態(tài)探針有效地克服了上述研究的不足，合成示意圖充分說明了TA-Gd＠RB的制備路線。本研究以硝酸釓和單寧酸為金屬配體源，在堿性條件下首次合成了釓-酚配位聚合物納米顆粒。由于納米粒子表面含有大量的羥基基團，成為一種高度修飾的MRI造影劑納米載體，這樣的結構能夠使載體表面有更多的可以修飾的基團，使其實現(xiàn)功能的多樣化。隨后，熒光基團羅丹明B以共價鍵結合在Gd-酚配位聚合物納米顆粒的表面，構建最終的MRI/FI雙峰成像探針。TA-Gd＠RB呈實心球形結構，尺寸為50～100 nm，水溶性極佳，探針的縱向r1值為6.94 mmol-1s-1，具有良好T1造影劑效果。同時，探針所載的熒光含量較高，發(fā)射波長較長，達590 nm，其所具有的紅色熒光特性使其在一定程度上具有抵抗生物背景干擾的能力。

在體內(nèi)MR成像的研究中，TA-Gd＠RB肝臟的信號增強時間長，強化幅度高，這表明TA-Gd＠RB在靜脈給藥后很快進入肝臟并實現(xiàn)T1增強信號，肝臟的信號在注射后4 h內(nèi)繼續(xù)增加，4 h后逐漸減弱至注射前的水平，表明TA-Gd＠RB在體內(nèi)有著長時間的血液循環(huán)時間，這主要得益于TA-Gd＠RB有著良好的形貌和納米尺寸結構，降低了其在體內(nèi)血液中的降解速率，為提升成像窗口時間提供了保證，也有效地解決了既往研究中［22-23］MRI/FI雙模態(tài)影像探針成像效果好而穩(wěn)定性差的不足。而膀胱在注射TA-Gd＠RB后的持續(xù)強化，表明TA-Gd＠RB 能夠在體內(nèi)被降解并釋放小分子Gd3+螯合物，并及時地經(jīng)膀胱清除體外，避免了Gd3+螯合物在體內(nèi)長時間的滯留所帶來的潛在毒性可能，保證了TA-Gd＠RB的安全性。

在觀察TA-Gd＠RB的熒光實驗中，我們發(fā)現(xiàn)腦組織可以觀察到微弱的熒光信號，這表明TA-Gd＠RB具有穿過血腦屏障的潛在可能性。更重要的是，主要器官的熒光信號可以間接反映TA-Gd＠RB在小鼠體內(nèi)的代謝途徑。首先，在注射后0.5 h檢測到腎臟和睪丸中的強熒光信號，并且這兩個器官中的熒光信號隨著時間的增加而基本同步衰減，這表明TA-Gd＠RB可以通過腎臟系統(tǒng)的新陳代謝排出體外，與體內(nèi)磁共振成像結果相符合，有效的保證其安全性。另外，小腸區(qū)域的熒光信號總是最強的，這可能是因為TA-Gd＠RB會在小腸中積累或通過腸道排出體外。同時在胃、肝和大腸器官中也發(fā)現(xiàn)了熒光信號的同步衰減，這表明該復合物在肝臟中代謝后可能以糞便的形式從腸道系統(tǒng)排出。總體而言，TA-Gd＠RB在體內(nèi)的存在兩條代謝途徑，經(jīng)膀胱排泄和從糞便經(jīng)腸道排出，代謝途徑的增多，表明TAGd＠RB能有效的被清除出體外，極大地增加了其使用的安全性。

綜上，基于釓-酚類配位聚合物的新型MR/FI雙模態(tài)影像探針TA-Gd＠RB具有優(yōu)異的FI/MRI性能，相信該探針在未來能有效地可視化其它疾病模型，促進用于疾病診斷的分子成像探針的發(fā)展。