LncRNA NEAT1 通過miR-129-5p/TNFRSF11A 軸調控宮頸癌發展的機制研究

于志娟（通訊作者），王立國

（赤峰市醫院婦產科 內蒙古 赤峰 024000）

宮頸癌為全球女性三大常見癌癥，發病原因尚不明確，早婚早育、性生活紊亂女性患病率較高。宮頸癌早期治療具有良好效果，中晚期患者的預后差，故早期發現并治療是提高宮頸癌生存率的關鍵，尋找用于宮頸癌早期診斷與預后判斷的生物學標記物對臨床具有重要意義[1]。LncRNA 在腫瘤發生發展中發揮關鍵調控作用，參與多種腫瘤發生發展過程，但目前尚未充分研究出NEAT1在宮頸癌中生物學功能。NEAT1 與miR-129-5p 在宮頸癌中作用關系也無明確報道[2-3]。本研究將宮頸癌細胞作為研究，檢測Hela 細胞中NEAT1、miR-129-5p 表達情況，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

人宮頸癌（Hela）細胞和正常宮頸細胞來源于AT CC；胎牛血清、DMEM 培養基、胰蛋白酶等購于GIBCO 公司。

1.2 方法

細胞培養與轉染：將人宮頸癌細胞株與人宮頸上皮細胞放于DMEM 培養液中，于培養箱中培養。進行LncRNA NEAT1、miR-129-5p、TNFRSF11A 轉染；將敲減NEAT1 陰性對照（si-con）、敲減NEAT1（si-NEAT1）、miR-129-5p 模擬物、過表達miR-129-5p 陰性對照（miR-NC）按要求轉染至Hela 細胞，轉染6 h 后更換培養基常規培養，qRT-PCR 檢查轉染情況，成功后備用[4]。

qPCR 檢測：采用TRIzol 法分別提取宮頸癌細胞與細胞總RNA；后通過NanoDrop 檢測RNA 濃度與純度，逆轉錄制備cDNA。取逆轉錄產物檢測PCR，按試劑盒說明建立PCR 反應體系；PCR 循環參數設置：95 ℃下5 min，3 步反應；94 ℃下變性30 s，60 ℃下退火30 s，45 個循環。結果通過2-ΔΔCt法計算。

Wb 檢測宮頸細胞TNFRSF11A 與上皮間質轉化相關蛋白表達：提取細胞蛋白后檢測蛋白濃度，上樣緩沖液中加入萃取蛋白，加熱至95 ℃并維持10 min；每孔樣品載藥量為30 μg，加入10%聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白；經聚偏二氟乙烯轉膜后將蛋白密封在牛血清蛋白中1 h，加入一抗后在4 ℃下過夜培養；緩沖液沖洗后加二抗于室溫下培養；洗膜3 次，加化學發光試劑顯影蛋白。

CCK-8 檢測癌細胞增殖：將癌細胞接種在96 孔板，于Caski、HeLa 細胞中轉染NEAT1、miR-129-5p、TNFRSF11A；檢測前1 h 每孔加入CCK-8 溶液，培養箱中孵育4 h，用酶標儀檢測光密度值。

Transwell 實驗檢測癌細胞侵襲力：將轉染細胞作為研究組，未轉染作為對照組；各組細胞經胰酶消化處理，接種在Transwell 小室孔板中，上室加細胞懸液，下室加胎牛血清的培養基，于培養箱中培養后取出小室，擦去微孔膜上室細胞，緩沖液沖洗，固定侵襲并黏附至小室微孔膜下方細胞，結晶紫染色，沖洗小室后干燥，于倒置顯微鏡觀察。

染色流式細胞術檢測癌細胞凋亡：選擇轉染與未轉染組Caski、HeLa 細胞培養至對數生長期，沖洗后，混合細胞與預冷緩沖液結合，避光孵育，上機前加PI 染色，用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據處理。正態分布的計量資料采用均數±標準差（± s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料用頻數表示，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 宮頸癌組織NEAT1、miR-129-5p 表達

相對于正常宮頸細胞，Hela 細胞中NEAT1 表達上升，miR-129-5p 表達下降（P＜0.05），見表1。

表1 組織NEAT1、miR-129-5p 表達比較（ ± s）

表1 組織NEAT1、miR-129-5p 表達比較（ ± s）

組別NEAT1miR-129-5p正常宮頸細胞1.09±0.142.74±0.29宮頸癌Hela 細胞3.18±0.360.96±0.10 t 8.6119.054 P＜0.001＜0.001

2.2 敲減NEAT1 對宮頸癌細胞影響

si-NEAT1 組Hela 細胞NEAT1 表達低于si-NC 組（P＜0.05）， 細胞活性降低（P＜0.05）；si-NEAT1 組遷移與侵襲細胞數低于si-NC 組（P＜0.05），見表2。

表2 敲減NEAT1 對宮頸癌細胞影響（ ± s）

表2 敲減NEAT1 對宮頸癌細胞影響（ ± s）

侵襲細胞/個si-NC 組3.18±0.31 1.36±0.15 48.64±5.37 47.39±4.16 si-NEAT1 組 1.01±0.08 0.81±0.07 19.95±6.01 13.31±5.71 t 7.56118.56225.314 P＜0.001＜0.001＜0.001組別NEAT1細胞活性（OD490 nm）遷移細胞/個

2.3 過表達miR-129-5p 對宮頸癌細胞影響

miR-129-5p 組Hela 細胞中miR-129-5p 表達高于miR-NC 組（P＜0.05），細胞活性降低（P＜0.05）；miR-129-5p 組遷移與侵襲細胞數低于miR-NC 組（P＜0.05），見表3。

表3 過表達miR-129-5p 對宮頸癌細胞影響（ ± s）

表3 過表達miR-129-5p 對宮頸癌細胞影響（ ± s）

侵襲細胞/個miR-NC 組0.93±0.07 1.42±0.14 51.36±5.14 43.53±3.11 miR-129-5p 組 2.41±0.23 0.85±0.07 18.32±1.15 12.75±1.42 t 9.2516.85431.05234.053 P＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別miR-129-5p細胞活性（OD490 nm）遷移細胞/個

3.討論

宮頸癌為女性常見惡性腫瘤，病死率高。宮頸脫落細胞檢測為宮頸癌篩查的標準方式，能有效降低宮頸癌發病率與病死率，但篩查仍具有一定局限性。由于臨床缺少有效早期診斷方法，宮頸癌多發展為浸潤性癌癥，降低患者生存率。近年來臨床已證實LncRNA 的生物學功能，機制涉及DNA 甲基化、多形式組蛋白修飾、RNA 干擾、染色質重構等，通過調控基因轉錄、轉錄后調控與表觀遺傳學等影響靶基因沉默和細胞周期變化，且能影響剪切、翻譯方式，進而促進腫瘤發生發展。LncRNA 為新型生物學標記物，表達水平聯合癌癥病理與預后在臨床中得到廣泛研究應用。多個研究指出LncRNA MALAT1與宮頸癌發生發展可能存在關聯，本研究對LncRNA MALAT1 與宮頸癌的相關性進行研究[5-6]。本研究發現LncRNA MALAT1 表達在癌組織與癌旁組織中差異顯著，提示LncRNA MALAT1 與宮頸癌發生發展可能有一定促進作用[7]。miR-129-5p 與多腫瘤發生發展密切相關，外源性miR-129-5p 可抑制宮頸癌細胞增殖、促進凋亡并阻斷HeLa 細胞周期進展，但miR-129-5p 對宮頸癌侵襲、轉移等機制尚不明確。研究顯示，miR-129-5p 過量表達能抑制胃癌細胞侵襲與增殖，故miR-129-5p 過表達對宮頸癌細胞侵襲可能有抑制作用[8]。本研究顯示miR-129-5p 過表達中miR-129-5p 組細胞中miR-129-5p 表達高于miR-NC 組，遷移與侵襲細胞數低于miR-NC 組，說明抑制miR-129-5p 表達可逆轉敲減NEAT1 對宮頸癌細胞活性、遷移侵襲抑制作用[9]。

綜上所述，LncRNA NEAT1 可下調miR-129-5p/TNFRSF11 A 軸促進宮頸癌發展，該機制可為宮頸癌治療提供靶點。