古巴栓孔菌胞內及胞外多糖的體外生理活性*

劉柯靈，李奕葶，史維麗，班立桐，孫 寧，黃 亮

（天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384）

古巴栓孔菌（Tramtes cubensis） 是一類屬于多孔菌科 （Polyporaceae） 栓菌屬 （Trametes） 的大型木腐真菌。栓菌屬含有的大量藥用真菌，具有抗炎、降血糖、抗腫瘤和抗氧化等功效[1]。迄今為止，栓菌屬中被馴化的有云芝（Coriolus versicolor）、香栓菌（Trametes suaveloens）、血紅栓菌 （Trametes san－guinea）、迷宮栓孔菌 （Trametes gibbosa） 等[2-4]。目前，關于古巴栓孔菌的研究鮮有報道，其藥用價值以及生理活性亟待深入研究。

真菌多糖具有良好的生理活性，如抗氧化、抗腫瘤、抑菌與調節免疫等[5]。雖然目前沒有關于古巴栓孔菌多糖的相關文獻報道，但已有研究證實同樣屬于多孔菌科的靈芝（Ganoderma lucidum）、茯苓（Poria cocos）、灰樹花 （Griflola frondosa），以及同屬多孔菌科栓菌屬的云芝、紅栓菌（Trametes sanguinea）等藥用真菌的多糖就具有顯著的生理活性[6]。如靈芝多糖不僅具有提高免疫力的作用，還具有抗腫瘤與降血糖等效果[7-10]；茯苓多糖具有增強免疫力的作用，Pu[11]研究表明茯苓多糖PCP（Poria cocos polysaccharide,PCP） 能激活NF-κB蛋白通過Ca2+/PKC/p38信號通路發揮免疫功能效果；灰樹花多糖在真菌多糖中具有最顯著的抗癌活性，其機制可能與增加BAK-1基因的表達，引起細胞凋亡有關[12]；云芝多糖具有顯著的抑制腫瘤、調節免疫、消炎護肝、抗氧化等生理活性[13]；朱紅栓菌子實體與菌絲體的胞內和胞外多糖，均具有良好的抗腫瘤以及調節免疫等效果[14]。

因此，為了進一步探究古巴栓孔菌多糖的生理活性，通過液體深層發酵方法，獲取古巴栓孔菌的胞內多糖與胞外多糖，對其進行分離提取，并考察其體外抗氧化能力、α-淀粉酶抑制活性以及亞硝酸鹽清除能力，綜合評價這2種多糖的生物活性。試驗結果不僅為古巴栓孔菌多糖的開發利用和進一步研究提供了一定的理論與數據基礎，還為其他藥用真菌多糖的研究與應用提供了思路和方向。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株采自福建省廈門市廈門熱帶植物園，經鑒定為古巴栓孔菌[1]，并保藏于天津農學院食用菌研發中心。

1.2 主要試劑

拜唐蘋阿卡波糖片（50 mg/片），拜耳醫藥保健有限公司；枯草芽孢桿菌α-淀粉酶（≥4 000 U·g-1、豬胰腺α-淀粉酶（≥10 u·mg-1），上海鼓臣生物技術有限公司；ABTS，北京索萊寶科技有限公司；DPPH，東京化成工業株式會社；可溶性淀粉，天津市風船化學試劑科技有限公司。

1.3 主要儀器設備

JY88-II超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；Alpha1-2LDplus冷凍干燥機，德國克萊斯特有限公司；Centrifuge5430臺式高速離心機，德國艾本德生命科學公司；Enspire酶標儀，美國珀金埃爾默（上海）有限公司；DNP-9272BS-III電熱恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；ZWY-2112B恒溫培養振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種的培養

平板培養：取保存于PDA斜面培養基上的菌種于新鮮PDA固體培養基，25℃條件下靜置培養7 d。PDA固體培養基配方：土豆提取物 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，pH 自然。

種子液培養：從平板培養基上取3塊5 mm2的菌塊，接入液體培養基，250 mL搖瓶裝液量為100 mL，于25℃、160 r·min-1條件下培養7 d。種子液體培養基配方：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸粉5 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、 MgSO40.5 g·L-1、VB10.01 g·L-1，蒸餾水1 L，pH自然。

液體深層發酵培養：將種子液按5%（v/v）的接種量接種于液體深層發酵培養基，250 mL搖瓶裝液量 100 mL，于 25℃、160 r·min-1條件下培養7 d[15]。發酵液配方：葡萄糖25 g·L-1、牛肉浸膏25 g·L-1、KH2PO41 g·L-1、 MgSO40.5 g·L-1、VB10.01 g·L-1，蒸餾水 1 L，pH 5。

1.4.2 發酵液體積及菌絲體生物量的測定

液體深層發酵培養7 d后，利用孔徑0.09 mm的過濾篩分離菌絲體和發酵液，分別收集。計算發酵液體積，收集后的菌絲體于40℃烘干、稱重后備用。

1.4.3 胞外多糖和胞內多糖的提取

1）胞外多糖的提取

將發酵液濃縮至原體積的1/4，加入其4倍體積的無水乙醇，于4℃冰箱靜置12 h，7 000 r·min-1離心并收集沉淀。沉淀溶于蒸餾水，用Sevage法去除其蛋白質成分，重復3次～5次，水相部分為胞外粗多糖溶液，收集后濃縮、凍干、稱重，儲存于干燥箱中備用。

2）胞內多糖的提取

將收集到的菌絲體粉碎，采用超聲波輔助水提法，提取菌絲體胞內多糖，料液比1∶15、功率150 W、超聲時間30 min[13]。水提后7 000 r·min-1離心15 min，取上清，濃縮到原體積的1/4，加入其4倍體積的無水乙醇，在4℃冰箱靜置12 h，再次離心后收集沉淀，沉淀溶于蒸餾水，用Sevage法去除其蛋白質成分，重復3次～5次，水相部分為胞內粗多糖溶液，收集后濃縮、凍干、稱重，儲存于干燥箱中備用。

1.4.4 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[16-17]測定古巴栓孔菌胞內多糖與胞外多糖的含量。向試管中加入1 mL的多糖稀釋樣品液、5%苯酚試劑0.5 mL以及2.5 mL濃H2SO4，搖勻，煮沸15 min，冷卻后，在490 nm波長處測定。每組3個平行，由葡萄糖標準曲線回歸方程計算得出多糖含量。

1.4.5 抗氧化活性的測定

1） DPPH自由基清除活性

參考LI[17]與王敏[18]所述方法進行，略做修改。將凍干后的多糖粉末，配制成質量濃度梯度分別為0.156 mg·mL-1、 0.313 mg·mL-1、 0.625 mg·mL-1、1.500 mg·mL-1、 2.500 mg·mL-1、 5.000 mg·mL-1、10.000 mg·mL-1的多糖溶液。取多糖樣品溶液125 μL，加入500 μL的DPPH乙醇溶液（25 μg·mL-1），混合均勻后，置于黑暗處反應30 min；然后在517 nm波長下用酶標儀測定吸光度值，試驗重復3次。DPPH自由基清除率（E1，%）計算公式為：

式中：A0為蒸餾水替代樣品的反應體系吸光度值；A1為不同濃度多糖溶液的反應體系吸光度值；A2為蒸餾水替代DPPH溶液的反應體系吸光度值。

2） ABTS·+清除活性

參考張燕所述方法[19]并略作修改。將凍干的多糖粉末，配制成質量濃度梯度分別為0.156 mg·mL-1、0.313 mg·mL-1、 0.625 mg·mL-1、 1.500 mg·mL-1、2.500 mg·mL-1、5.000 mg·mL-1、10.000 mg·mL-1的多糖溶液。取多糖樣品50 μL，加入ABTS·+溶液450 μL，混合均勻后反應10 min；然后在734 nm波長下用酶標儀測定其吸光度值，重復測試3次。ABTS·+自由基清除率 （E2，%） 計算公式為：

式中：A0為蒸餾水替代樣品的反應體系吸光度值；A1為不同濃度多糖溶液以及陽性對照VC的反應體系吸光度值；A2為蒸餾水替代ABTS·+溶液的反應體系吸光度值。

3） 羥基自由基清除活性

根據李霞[20]與李奕葶[17]所述方法并略作修改。將凍干的多糖粉末，配制成質量濃度梯度為0.156 mg·mL-1、0.313 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、1.500 mg·mL-1、 2.500 mg·mL-1、 5.000 mg·mL-1、 10.000 mg·mL-1的多糖溶液。取 9 mmol·L-1的 FeSO4與 9 mmol·L-1的水楊酸-乙醇溶液各1 mL，搖勻后加入多糖溶液1 mL、8.8 mmol·L-1的H2O2溶液1 mL；水浴37℃反應1 h后，冷卻至室溫；在510 nm下測吸光度值，重復測試3次。羥基自由基清除率（E3，%）計算公式為：

式中：A0為蒸餾水替代樣品的反應體系吸光度值；A1為不同濃度多糖溶液以及陽性對照VC的反應體系吸光度值；A2為蒸餾水替代水楊酸溶液的反應體系吸光度值。

4） 超氧陰離子清除活性

利用鄰苯三酚氧化法[21]進行多糖超氧陰離子清除率的測定。將凍干后的多糖粉末，配制成質量濃度梯度為 0.156 mg·mL-1、0.313 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、1.500 mg·mL-1、2.500 mg·mL-1、5.000 mg·mL-1、10.000 mg·mL-1的多糖溶液。取pH 8.2的Tris-HCl緩沖液3 mL和多糖溶液1 mL，25℃下保溫20 min；加入25℃下預熱的7 mmol·L-1的鄰苯三酚0.3 mL準確反應 4 min，加入 10 mmol·L-1的 HCl溶液 1 mL終止反應；在420 nm處測定其吸光度值，試驗重復3次，取其平均值，計算清除率。超氧陰離子清除率（E4，%） 計算公式為：

式中：A0為蒸餾水替代樣品的反應體系吸光度值；A1為不同濃度多糖溶液以及陽性對照VC的反應體系吸光度值；A2為蒸餾水替代鄰苯三酚溶液的反應體系吸光度值。

1.4.6 α-淀粉酶活性抑制試驗

采用碘-淀粉比色法分別測定古巴栓孔菌胞內多糖及胞外多糖對豬胰腺、枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶的抑制活性[22]。試驗在0.1 mol·L-1、pH 7.0的磷酸鉀緩沖液酶活力測定體系中進行。將凍干后的多糖粉末，配制成質量濃度梯度分別為0.156 mg·mL-1、0.312 mg·mL-1、 0.625 mg·mL-1、 1.500 mg·mL-1、2.500 mg·mL-1、5.000 mg·mL-1、10.000 mg·mL-1的多糖溶液。在試管中加入不同濃度的待測多糖樣品0.05 mL以及0.3 g·L-1的可溶性淀粉溶液1 mL，于37℃溫浴 5 min后加入 0.01 mg·mL-1的 α-淀粉酶0.05 mL。45℃反應 3 min后，加入 0.01 mol·L-1的碘液1 mL進行檢測，在紫外分光光度計660 nm處測定吸光度值，陽性對照為阿卡波糖。化合物對α-淀粉酶的抑制率（E5，%）計算公式為：

式中：A0為淀粉溶液與碘液反應后的吸光度值；A1為不同濃度多糖溶液以及陽性對照阿卡波糖的反應體系吸光度值。

1.4.7 亞硝酸鹽清除能力的測定

將凍干后的多糖粉末，配制成質量濃度梯度分別為 0.156 mg·mL-1、0.312 mg·mL-1、0.625 mg·mL-1、1.500 mg·mL-1、 2.500 mg·mL-1、 5.000 mg·mL-1、10.000 mg·mL-1的多糖溶液。在試管中加入濃度為5.0 μg·mL-1亞硝酸鈉標準溶液1 mL以及不同濃度多糖溶液2 mL，反應10 min后加入0.4%的對氨基苯磺酸溶液2 mL，靜置5 min后再加入0.2%的鹽酸萘乙二胺1 mL，顯色后靜置15 min，在波長538 nm處測定吸光度值，陽性對照為VC溶液[24]。多糖對亞硝酸鹽的清除率（E6，%）計算公式為：

式中：A1為不同濃度樣品溶液的吸光度值；A0為蒸餾水代替樣品反應的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 菌絲體生物量與多糖含量

經液體深層發酵后，古巴栓孔菌菌絲體生物量為 （2.15± 0.08） g·L-1，胞內多糖含量為 （15.42±0.26） mg·g-1，胞外多糖的含量為 （44.82 ± 1.04）mg·L-1，去除蛋白質后的胞內多糖占提取物總質量的91%，胞外多糖占提取物總質量的94%。對比4種姬松茸與13種野生靈芝的胞外多糖以及胞內多糖含量[24-26]，古巴栓孔菌的胞外與胞內多糖含量均較低，究其原因與提取方法和發酵條件相關，后續試驗會進一步探討多糖的最優提取條件與最適發酵條件。

2.2 抗氧化活性

古巴栓孔菌多糖對DPPH自由基清除活性試驗結果見圖1。

圖1 多糖對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of polysaccharide on DPPH·

圖1結果表明，陽性對照VC對DPPH自由基有很強的清除作用，濃度為0.156 mg·mL-1的VC的清除率即可達到80%以上。在0.156 mg·mL-1～10.000 mg·mL-1內，古巴栓孔菌的胞內多糖對DPPH自由基的清除率隨其濃度的增加而提高，在0.625 mg·mL-1～10.000 mg·mL-1范圍內清除率明顯提升，最高可達57.32%。而古巴栓孔菌的胞外多糖的最高清除率只有23.64%，且隨濃度的升高，清除率并無明顯變化。雖然古巴栓孔菌的胞內多糖對DPPH·的清除率低于VC，但也具有一定的抗氧化活性，而胞外多糖抗氧化活性明顯較弱。

ABTS·+清除試驗通常用于評價化合物總抗氧化活性[24]，古巴栓孔菌多糖對ABTS·+清除活性試驗結果見圖2。

圖2 多糖對ABTS·+的清除率Fig.2 Scavenging rate of polysaccharide on ABTS·+

如圖2所示，古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖均呈現良好的抗氧化活性，其胞內多糖在2.5 mg·mL-1濃度時，清除率已基本達到100%，與陽性對照相似。胞外多糖濃度在10 mg·mL-1時，清除率也達到100%。所測樣品質量濃度范圍內，隨著質量濃度增加其ABTS·+清除活性隨之明顯增強，2種多糖都表現出較強的ABTS·+清除活性。

古巴栓孔菌多糖對羥基自由基清除活性試驗結果見圖3。

圖3 多糖對羥基自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of polysaccharide on·OH

圖3結果表明，陽性對照VC對羥基自由基有很強的清除作用，并且古巴栓孔菌的胞內多糖與胞外多糖的清除率隨著濃度的增加而提高。結果還表明，多糖濃度在2.5 mg·mL-1～10.0 mg·mL-1范圍內，古巴栓孔菌胞內多糖對羥基自由基的清除作用急劇上升；測試濃度范圍內古巴栓孔菌的胞外多糖對羥基自由基的清除作用也隨濃度的增加平穩升高，最高可達到92.85%。因此古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖對羥基自由基也具有一定的抗氧化活性。

古巴栓孔菌多糖對超氧陰離子清除活性試驗結果見圖4。

圖4 多糖對超氧陰離子的清除率Fig.4 Scavenging rate of polysaccharide on O2-·

由圖4可知，多糖濃度范圍為0.156 mg·mL-1～10.000 mg·mL-1內，2種多糖對超氧陰離子的清除作用平穩上升，且與陽性對照VC對超氧陰離子清除作用相差較小。在濃度為10 mg·mL-1時，古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖對超氧陰離子的清除作用最高，胞內多糖的清除率為94.52%，胞外多糖為93.61%。而陽性對照VC的最高清除率為95%，說明古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖對超氧陰離子的清除效果較好，且兩者效果相差不大。

2.3 α-淀粉酶抑制活性

α-淀粉酶抑制活性通常被用作評價降血糖能力的指標之一[27]，古巴栓孔菌多糖對豬胰腺來源α-淀粉酶抑制活性試驗結果見圖5。

圖5 多糖對豬胰腺來源α-淀粉酶活性的抑制率Fig.5 Inhibition rate of polysaccharide on α-amylase activity of porcine pancreas

如圖5所示，陽性對照阿卡波糖對α-淀粉酶的抑制活性隨濃度升高而提升，當濃度為10 mg·mL-1時，其抑制率達到90.11%。而胞內與胞外多糖在濃度為 0.156 mg·mL-1～2.500 mg·mL-1時，對 α-淀粉酶的抑制率均低于陽性對照阿卡波糖，且抑制率無明顯梯度變化，基本在42.84%～45.08%。當濃度上升至5 mg·mL-1時，胞內與胞外多糖對α-淀粉酶的抑制率均有大幅提升，且胞內多糖α-淀粉酶抑制率最高為56.81%；胞外多糖濃度為10 mg·mL-1時，α-淀粉酶的抑制率最高為55.98%。因此，古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖對豬胰腺來源的α-淀粉酶具有一定的抑制活性，且效果相似。

古巴栓孔菌多糖對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶抑制活性試驗結果見圖6。

由圖6可知，胞內與胞外多糖質量濃度在0.156 mg·mL-1～10.000 mg·mL-1時，陽性對照阿卡波糖對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶的抑制活性隨濃度提升；當濃度達到10 mg·mL-1時，其抑制率達到95.24%。而古巴栓孔菌胞內與胞外多糖在濃度為0.156 mg·mL-1～2.500 mg·mL-1時，抑制效果無明顯差距，基本為58.92%～64.32%。當古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖質量濃度為5 mg·mL-1時，抑制效果有明顯的提升，且抑制率均達到最高，分別為74.06%與72.30%。而當濃度達到10 mg·mL-1時，古巴栓孔菌的胞內與胞外多糖對α-淀粉酶的抑制活性均有所下降。

圖6 多糖對枯草芽孢桿菌來源α-淀粉酶活性的抑制率Fig.6 Inhibition rate of polysaccharide on α-amylase activity from Bacillus subtilis

2.4 亞硝酸鹽清除能力

古巴栓孔菌多糖對亞硝酸鹽清除能力試驗結果見圖7。

圖7 多糖對亞硝酸鹽的清除能力Fig.7 Scavenging rate of polysaccharide on nitrite

如圖7所示，陽性對照VC對亞硝酸鹽的清除作用明顯，0.156 mg·mL-1VC的清除率就已經達到50.61%，最高清除率可達88.86%。在0.15 mg·mL-1～10.000 mg·mL-1，古巴栓孔菌的胞內多糖與胞外多糖對亞硝酸鹽的清除率隨其濃度的增加，在1.25 mg·mL-1～10.00 mg·mL-1其清除率明顯提升，胞內與胞外多糖抑制率最高可達60.13%和58.97%。

3 討論與結論

真菌多糖可以與自由基結合，形成抑制物阻止氧化，促進抗氧化酶生成以及提高抗氧化酶活性，因此具有抗氧化能力[26-28]。本研究結果表明，在清除羥自由基、ABTS·+、超氧陰離子的能力中，古巴栓孔菌的胞內多糖與胞外多糖能力相差不大。但是在對DPPH自由基的清除中，2種多糖的能力差距明顯，古巴栓孔菌胞內多糖的清除能力比胞外多糖顯著，并且隨著濃度的升高，清除能力也逐步提升。與栓菌屬中奶油栓孔菌（Trametes lactinea） 子實體多糖抗氧化活性相比，奶油栓孔菌子實體多糖濃度在1 mg·mL-1時，ABTS·+清除能力為100%；濃度增加至4 mg·mL-1時，其DPPH·清除能力為79.64%，超氧陰離子的清除能力為43.57%[29]。由此可見，奶油栓孔菌子實體多糖對ABTS+·和DPPH·清除能力，均優于本研究中提取的古巴栓孔菌胞外與胞內多糖。

α-淀粉酶可以將淀粉水解成低分子的糖類物質，抑制其活性可以緩解人體內淀粉的降解與葡萄糖的吸收。所以α-淀粉酶抑制劑可以降低II型糖尿病患者餐后血糖水平，以及減少糖尿病并發癥的發生。因此，從果、蔬、谷物、菌類等天然產物中尋找α-淀粉酶抑制劑成為當今研究的熱點方向[30]。近年的研究證實，真菌多糖具有顯著的抑制α-淀粉酶活性的效果，其抑制活性與多糖的分子結構、空間構象以及含有的雜質含量等均相關[31]。李井雷等[32]的試驗表明，純化后的羊肚菌胞外多糖具有良好的α-淀粉酶抑制活性，且濃度達到0.8 mg·mL-1時，其抑制活性達到60%左右，與未純化的古巴栓孔菌胞內和胞外多糖相比，具有顯著的抑制效果，究其原因與多糖的種類以及純化程度均有密切聯系。

亞硝酸鹽既可以直接導致DNA損傷，還能在酸性條件下與氨基酸和胺類物質反應生成亞硝胺，具有強致癌性。一些化學成分如黃酮類、多酚類、皂苷類、多糖類等，能與亞硝酸根發生化學反應，從而達到清除亞硝酸鹽的作用[23]。目前，古巴栓孔菌的多糖對亞硝酸鹽清除效果的研究尚未見報道，本研究結果顯示2種多糖濃度達到10 mg·mL-1時，亞硝酸鹽清除率均超過50%，具有較顯著的清除能力。

綜上所述，古巴栓孔菌的胞內、胞外多糖具有較顯著的抗氧化和亞硝酸鹽清除能力，而且對α-淀粉酶的活性抑制效果明顯。試驗結果為古巴栓孔菌胞內、胞外多糖的進一步研究提供了一定的數據及理論依據，為其作為功能性食品或食品添加劑奠定了研究基礎。今后，將對2種多糖進一步研究，通過離子交換柱層析的方法進行純化，深入探討各種生理活性與多糖的構效關系。