大型真菌凝集素的結構、糖特異性以及其在免疫調節中的研究進展*

劉韻然，游金坤，鄧雅元，王 娟，楊璐敏，遲 蔚

（1.云南省供銷合作社科學研究所，云南 昆明 650221；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

凝集素是一類不具有免疫原性和酶活性的蛋白質，包含一個或多個糖識別域，可與多種不同類型的單糖及低聚糖糖結構進行高度選擇性和特異性的結合，而不改變其共價結構[1]。通常凝集素因其可凝集紅細胞而被稱為血凝素，但隨著對凝集素研究的深入，發現并非所有血凝素均通過與細胞表面的糖可逆性結合來凝集紅細胞，而只有凝集素才具有這種活性[2]。此外，凝集素依靠定向選擇結合糖基從而特異性識別外源細胞，因此還具有免疫調節活性、促進有絲分裂、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、介導寄生生物與宿主間的相互作用[3]。目前，已經從植物、動物、微生物中分離純化得到凝集素，并因其所具備的多種生物活性，在生物醫學、免疫學中展現出廣闊的應用前景。

大型真菌作為獲取凝集素的新來源，引起越來越多學者的關注。隨著對各類大型真菌藥理學研究的深入，凝集素、多糖、三萜類等活性物質被提取和純化，大型真菌的免疫調節、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性也被相繼發現。目前，大型真菌凝集素因具有凝集細胞活性、激活淋巴細胞分裂、刺激分泌免疫細胞因子、可特異識別特定的腫瘤、抑制腫瘤生長等免疫調節作用而在生化、臨床試劑開發領域有廣泛的應用，并逐漸成為細胞癌變、細胞分化、細胞分子識別及病原菌檢測等生命過程中有用的工具[4-5]。

1 大型真菌凝集素的結構

大型真菌凝集素通常由非共價相互作用結合2個到4個相同或不同的亞基組成[1]。目前，對于真菌凝集素結構的分析數據還十分有限，一些菌類凝集素，如荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes） 凝集素[6]等，顯示出獨特的結構折疊。被鑒定出的大多凝集素可以按照其晶體結構的折疊形式和特征大致分為4個折疊類型，包括β螺旋折疊、半乳凝集素樣折疊、β三葉折疊和類海葵溶細胞素折疊。通過總結發現，結構相似的凝集素在一定程度上表現出部分相似的生物活性，為今后研究大型真菌凝集素的生物活性提供了思考方向。

1.1 凝集素β螺旋折疊結構

β螺旋結構家族中，以氈毛小脆柄菇（Psathyrella velutina） 凝集素[7]為代表，晶體結構呈七葉β螺旋折疊。晶粒鬼傘（Coprinus micaceus） 凝集素和角斑鬼傘（Coprinellus angulatus） 凝集素結構也被歸類為氈毛小脆柄菇凝集素樣結構[8]。相同折疊形式的還有橙黃網胞盤菌（Aleuria aurantia） 凝集素，呈六葉β螺旋折疊結構，具有與巖藻糖結合煙曲霉凝集素類似的多價糖識別結構域[9]。

1.2 凝集素半乳凝集素樣折疊結構

與半乳糖凝集素同源的大型真菌凝集素從灰蓋鬼傘 （Coprinopsis cinerea）[10]和柱狀田頭菇 （Agrocybe cylindracea）[11-12]中分離得到。從同擔子菌亞綱的灰蓋鬼傘中分離出來的3個凝集素CGL1、CGL2、CGL3及柱狀田頭菇凝集素AAL和ACG在無配體或是含β半乳糖苷低聚糖復合體的狀態下，結構與動物半乳糖凝集素結構基本重合，除了CGL3在結構中一個色氨酸被精氨酸所取代而造成CGL3無法與乳糖結合。已經有大量研究表明半乳糖凝集素在動物中參與了免疫調節、細胞增殖與凋亡等生物調控過程[13]，大型真菌的半乳糖凝集素CGL2和ACG也都已經被證實能與TF抗原結合，從而調控腫瘤細胞凋亡[10，12]。

1.3 凝集素β三葉折疊結構

β三葉折疊家族凝集素與蓖麻毒素b鏈蛋白結構域相似，由α、β和γ三個重復的亞結構域組成，家族成員包括水粉杯傘（Clitocybe nebularis）凝集素CNL[14]、硫磺菌（Laetiporus sulphureus）凝集素LSL[15]、硬柄小皮傘（Marasmius oreades） 凝集素MOA[16]、寬鱗多孔菌 （Polyporus squamosus） 凝集素PSL[17]、高大環柄菇（Macrolepiota procera） 凝集素MPL[18]、核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum） 凝集素SSA[19]和灰蓋鬼傘中分離純化的一種凝集素CCL2[20]及美味牛肝菌（Boletus edulis） 中的一種凝集素[21]。

有報道發現蓖麻毒素b鏈蛋白能與半乳糖/N-乙酰基半乳糖胺特定結構結合，具有調節免疫細胞活化的作用，促進小鼠脾臟淋巴細胞、CD4+T細胞和小鼠RAW264.7巨噬細胞增殖活化[22]。多個具有蓖麻毒素b鏈蛋白結構的大型真菌凝集素同樣被報道具有免疫調節活性[15-16，19，23]。Pohleven 等[23]研究證實水粉杯傘凝集素CNL是一種同型二聚體凝集素，每個單體包含一個蓖麻毒素b鏈蛋白結構域，并且僅有一個單一的碳水化合物結合位點位于每個單體的α重復序列上，其二價碳水化合物結合特性決定了其生物活性，CNL具有活化樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）、抗人白血病T細胞增殖等生物活性。核盤菌凝集素SSA與CNL相似，只有一個結合位點位于α重復序列上，而硫磺菌凝集素LSL、硬柄小皮傘凝集素MOA和寬鱗多孔菌凝集素PSL則不同，其是由非凝集素結構域和凝集素結構域構成的模式蛋白，凝集素結構域特異識別作用目標，非凝集素結構域介導發揮其生物活性；PSL在β重復序列上有一個結合位點并與α重復序列上的氨基酸殘基一起發揮作用，LSL則有2個結合位點分別位于β和γ重復序列上，而MOA有3個結合位點分別位于α、β和γ 3個重復亞結構域上。

1.4 凝集素類海葵溶細胞素折疊結構

紅絨蓋牛肝菌（Xerocomus chrysenteron） 凝集素XCL[24]與海葵溶細胞素的結構折疊形式高度相似，因此將XCL結構折疊稱為類海葵溶細胞素折疊。在其他研究中，通過結構比對和蛋白質編碼基因序列比對，發現雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 凝集素ABL[25]和美味牛肝菌的一種凝集素BEL[21]與XCL的三維立體結構基本相同，蛋白質編碼基因序列高度相似，并與黃白側耳（Pleurotus cornucopiae） 凝集素[26]一起歸類為鹽溶性凝集素家族。此類凝集素晶體結構特點是有6個β折疊股和4個β折疊股分別構成的2個β折疊片層，這兩個β折疊片層間通過螺旋-環-螺旋模體相連接。ABL中N-乙酰半乳糖胺與螺旋-環-螺旋模體上一側低陷部分的糖結合位點的結合與BEL中單糖的結合非常相似。在研究中發現，ABL、BEL和XCL蘑菇凝集素都能與T抗原特異性結合，且ABL的抗增殖活性可以通過結合TF抗原二糖Galβ1-3GalNAc進行調節[27]。

2 大型真菌凝集素的糖特異性

凝集素作為大型真菌的一種貯藏蛋白，與植物凝集素相比分布范圍廣，且其表達水平高，表達隨著環境、生長年齡等因素的改變而改變。目前已有許多研究發現，大多真菌凝集素從子實體中分離，還有部分僅在菌絲體中表達[28-30]。從不同品種的大型真菌中分離純化的凝集素分子質量、亞基數量、糖特異性各不相同，有的大型真菌凝集素具有單一的糖特異性，有的則具有多個糖結合位點，這些結合位點使凝集素與外源細胞相互識別，進而發揮其免疫調節、抗腫瘤等生物學活性功能。

Hassan等[30]綜合報道了國外大型真菌凝集素糖特異性的研究，國內外近十年間新增報道的大型真菌凝集素糖特異性補充見表1。

表1 大型真菌凝集素的糖特異性Tab.1 Carbohydrate specificity of macrofungi lectin

由表1可知，通過對比國內外已報道的大型真菌凝集素糖特異性，發現從不同產區同一品種大型真菌中分離得到的凝集素或是從同一菌株不同部位分離的凝集素，可能會有不同的糖特異性差異，也可能與試驗所用紅細胞來源不同有關。如從靈芝中分離出的凝集素，在Thakur[31]和Kawagishi[32]的報道中具有去唾液酸胎球蛋白和胎球蛋白的糖蛋白特異性，而在郭棟等[32]的研究中還發現其凝血活性能被木糖和D-果糖抑制。柱狀田頭菇凝集素在報道中被乳糖、半乳糖和半乳糖胺抑制凝血活性[30]，但孫慧等[34]分離純化的一種新柱狀田頭菇凝集素卻不與乳糖、半乳糖等發生特異性結合，反而被豬胃黏蛋白強烈抑制其凝血活性。

另外，部分大型真菌凝集素的糖特異則表現出專一性及穩定性。王文君等[35]發現了葡萄糖是姬松茸凝集素的專一結合糖。黃牛肝凝集素不與單糖和低聚糖發生特異性結合，而被胃粘蛋白強烈抑制凝血活性，與甲狀腺球蛋白、卵粘蛋白和卵清蛋白呈現濃度依賴性結合[36]；鱗柄小奧德蘑顯示出N-乙酰半乳糖胺特異性[37]；香菇凝集素被乳糖單一特異性結合[33]；乳菇凝集素的凝血活性被N-乙酰半乳糖胺抑制[38]。

糖特異性是大型真菌凝集素調節機體免疫的決定性因素[12，21]。如柱狀田頭菇凝集素ACG與TF抗原的識別主要通過與N-乙酰半乳糖胺的交互，BEL也是通過與TF抗原雙糖Galβ1-3GalNAc結合抑制腫瘤細胞增殖。因此研究大型真菌的糖特異性，可為進一步探究大型真菌凝集素活性功能的機理提供更多基礎數據。

3 大型真菌凝集素免疫調節作用的相關研究

大型真菌凝集素免疫調節作用的相關研究已經是其生物活性中重要的一部分，大型真菌凝集素可以通過免疫監視、激活巨噬細胞、致敏T淋巴細胞、B淋巴細胞、促進淋巴細胞有絲分裂、促細胞因子分泌等多種途徑來發揮免疫調節功能。

3.1 大型真菌凝集素的免疫監視作用

蛋白質糖基化貫穿于細胞的識別、信號傳導、細胞活化等過程中，異常的糖基化修飾新產生的肽鏈結構及位置，均會在免疫應答中產生影響，導致腫瘤免疫監視逃逸[49]。在關于糖基化與免疫監視相關的報道中，已經有大量研究證實腫瘤細胞表面表達出異常的糖基化修飾，如核心巖藻糖基化水平與胃癌細胞增殖程度呈現負相關，當核心巖藻糖基化水平下降時會導致胃癌細胞發生免疫逃避。另外N-乙酰氨基葡萄糖轉移酶（GnT） 糖基化和氧連N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc） 糖基化也通常在腫瘤細胞表面表達，因此靶向結合聚糖的生物治療手段得以重視[50]。

如前面所述，大型真菌凝集素的結構特征決定了其糖特異性，不同的大型真菌凝集素具有不同的糖特異性。而腫瘤的異常糖基化修飾是其癌變的重要特征，激活腫瘤免疫的有效手段之一即研究不同類型糖基化對腫瘤的影響。大型真菌凝集素的糖特異性特征在對腫瘤細胞的識別中可以發揮重要的作用，在細胞發生腫瘤惡變，或腫瘤細胞向正常組織浸潤時，優先對非正常細胞進行識別，可以作為免疫監視、靶向治療的重要佐劑。Kobayashi等[44]從翹鱗傘中分離純化的凝集素PhoSL對核心α1-6-巖藻糖基化N-聚糖穩定特異性結合，對巖藻糖基化甲胎蛋白具有很高的識別和結合作用，而巖藻糖基化甲胎蛋白在肝癌細胞中大量表達，從而認為PhoSL對肝癌細胞具有一定的免疫監視作用。

3.2 大型真菌凝集素激活免疫細胞

目前，已有學者對大型真菌凝集素活化免疫細胞的信號通路進行了研究，上游信號通路包括凝集素調節膜鈣離子通道或結合細胞表面Toll樣受體（toll-like receptors，TLRs） 通道均已經被證實。

草菇（Volvariella volvacea） 凝集素VVL被報道可以通過作用于L型鈣離子信號通道對T細胞鈣離子內流進行有效調控，L型鈣通道在T細胞受體（T cell receptors，TCR） 介導T細胞活化和增殖中至關重要，進而認為VVL通過TCR信號通道實現T細胞增殖和免疫應答[51]。

此外，由于凝集素具有的糖特異性，大多數文獻報道中認為大型真菌凝集素激活免疫細胞主要通過TLRs信號轉導[52-53]。TLRs是一類主要存在于免疫細胞表面的跨膜蛋白，不同的TLRs對不同的配體進行識別，以傳遞信號產生適應性免疫調節。TLRs通路活化包括2個主要信號過程，凝集素與免疫細胞表面受體的相互結合是激活細胞的第一信號，結合了的TLRs被觸發與細胞內接頭蛋白分子相結合為第二信號。第二信號的識別與結合主要有2種途徑，髓樣細胞分化因子MyD88依賴途徑和非依賴途徑，而后激活下游信號表達。

目前已經被證實是通過TLRs信號通路發揮免疫應答的菌類凝集素主要有水粉杯傘凝集素CNL、糙皮側耳凝集素POL和硫磺菌凝集素LSL，其中CNL和LSL都屬于β三葉折疊凝集素家族。Svajger等[53]發現CNL在10 μg·mL-1濃度下對TLR4活化能力與細菌脂多糖的激活能力相似，通過培養人TLR4細胞系，采用MyD88抑制劑和TLR4小分子特異性抑制劑CLI-095，以及單克隆抗體標記等方式，最終確定CNL通過TLR4/NF-κB方式介導激活DCs，產生TH1輔助細胞極化反應引發免疫應答。

Meina等[55]通過監測POL作用后TLR6的表達和TLR6的敲除試驗，證實POL與DCs表面TLR6特異性結合，刺激濾泡輔助性T細胞反應，產生慢性乙型肝炎病毒特異性抗體，引起免疫應答。Wang等[56]的研究則表明LSL主要通過TLR4信號通路作用于巨噬細胞。其他在凝集素與TLRs信號通路相關的綜合報道中提到的大型真菌凝集素則是通過凝集素的結構特點及下游細胞因子的檢測來推斷其信號通路，而事實上是否是通過TLRs通路進行免疫細胞激活還需要更多的研究依據。

3.3 大型真菌凝集素刺激細胞因子分泌

凝集素特異性結合受體能引起多種免疫細胞因子的分泌，如TLRs介導的促有絲分裂原活化蛋白激酶 （MAPK） 信號轉導通路和核因子 κB（NF-κB）通路，或是細胞外信號調節激酶，巨噬細胞的經典活化（M1） 和選擇性活化（M2） 等免疫調控相關途徑促進細胞因子分泌。Cheung等[57]通過檢測MAPK通路的分支路線Erk、Jnk、p38、Akt的磷酸化狀態和p53的表達水平，發現雙孢蘑菇凝集素ABL通過抑制Akt通路來抑制人視網膜色素上皮細胞的增殖。此后Ditamo等[58]發現ABL作用于巨噬細胞，通過轉變AKt信號通路，抑制NO的產生，同時作用于T細胞，降低先天免疫和適應性輔助性T細胞Th1反應，可以控制炎癥性自身免疫。黃東等[59]的研究中發現黑木耳凝集素通過NF-κB信號通路激活RAW264.7細胞，促進細胞因子分泌進行免疫調節。Svajger等[54]在確定了水粉杯傘凝集素CNL通過TLR4激活DCs后，同樣檢測了其下游信號通路NF-κB和p38 MAPK的激活水平，發現CNL通過下游信號通路NF-κB途徑調節免疫。

另外，雙孢蘑菇凝集素ABL和草菇凝集素VVL可以激活蛋白酪氨酸激酶p56lck進行免疫調節。p56lck屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶，且VVL被證實通過TCR調控T細胞有絲分裂，因此ABL和VVL對p56lck的激活途徑是由TCR通道活化T細胞，而并非通過MAPK信號通路轉導[60]。很多受體分布于巨噬細胞的表面，不同的刺激源與不同的受體結合，通過下游信號通路如JAK-STAT信號通道、NF-κB信號通道等，刺激巨噬細胞M1或M2活化分泌不同的細胞因子。北蟲草（Cordyceps militaris）凝集素可以通過提高STAT1 S727位點的磷酸化水平或是p38-T180/Y182的磷酸化水平，激活巨噬細胞M1型分化[61]。除此之外，大量的研究報道為大型真菌凝集素促免疫細胞因子的分泌提供了重要的試驗依據，見表2。

表2 大型真菌凝集素刺激細胞因子分泌Tab.2 Promoting cytokine secretory activity of macrofungal lectins

由表2可知，凝集素靶向作用于免疫細胞如巨噬細胞、DCs或輔助性T細胞，分別通過不同的信號通路刺激分泌細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素 （IL-2、IL-6、IL-8、IL-1α、IL-1β）、乙型肝炎病毒抗體等，從而發揮免疫調控作用。

3.4 大型真菌凝集素促進免疫細胞增殖

研究表明大型真菌凝集素能促進免疫細胞的有絲分裂，部分真菌的促細胞增殖情況見表3。

表3 大型真菌凝集素促細胞增殖Tab.3 Proliferation effect of macrofungal lectin

如表3所示，柱狀田頭菇凝集素、毛木耳凝集素、黑管菌凝集素、金針菇凝集素、靈芝凝集素、梯棱羊肚菌凝集素、阿魏菇凝集素、草菇凝集素和磚紅絨蓋牛肝菌凝集素等均對小鼠脾細胞或脾淋巴細胞有增殖促進作用。其中草菇凝集素被證實是通過TCR/鈣離子信號通道誘導細胞有絲分裂[72]。另外，靈芝凝集素、白茯苓凝集素能促進人淋巴細胞有絲分裂。細網牛肝菌凝集素和草菇凝集素能促胸腺細胞增殖。通過促進免疫細胞的增殖，調節機體的免疫活性。

4 結語

與其他動植物凝集素相似，大型真菌凝集素在結構上包含一個或多個糖識別域，高度選擇性和特異性結合多種糖，可以在免疫系統中細胞間的相互識別、信號傳導、細胞分化等多個生物過程中發揮重要作用。通過研究大型真菌凝集素的晶體結構和糖特異性，可發現結構相似或可結合相同糖分子的大型真菌凝集素，有一部分表達出相似的生物活性。特異性識別是大型真菌凝集素發揮免疫調節功能的主要方式，大型真菌凝集素可以通過免疫監視、活化免疫細胞、刺激分泌免疫細胞因子以及促進免疫細胞有絲分裂等方式來調節機體免疫，發揮免疫調控功能。大型真菌作為凝集素的新來源，成本經濟，生長周期短，在開發藥物靶向載體、免疫佐劑、定位識別等生物醫學領域有廣闊的應用前景。