硼替佐米原料藥細菌內毒素檢查方法研究*

張 璞

（重慶市食品藥品檢驗檢測研究院，重慶 401121）

硼替佐米為首個用于治療多發性骨髓瘤的蛋白酶抑制劑［1］。硼替佐米作為無菌制劑的非無菌原料藥，在N，N-二甲基甲酰胺、甲醇中易溶，在水中幾乎不溶。本研究中按2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細菌內毒素檢查法［2］和《中國藥品檢驗標準操作規范（2010 年版）》［3］，對硼替佐米原料藥細菌內毒素的檢查方法進行研究，為其他難溶性原料藥細菌內毒素檢查法的建立提供參考?，F報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

TAL-40D 型試管恒溫儀（湛江安度斯生物有限公司）；XPE205 型電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；VG3 S25 型渦旋混勻器（德國IKA 公司）；SW-CJ-2FD 型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 試藥

硼替佐米原料藥（某企業，批號分別以Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ指代）。鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號為1910283，靈敏度為0.25 EU／mL，規格為每支0.1 mL；批號為1910143，靈敏度為0.06 EU／mL，規格為每支0.1 mL。福州新北生化工業有限公司，批號為19120812，靈敏度為0.25 EU／mL，規格為每支0.1 mL；批號為19081612，靈敏度為0.125 EU／mL，規格為每支0.1 mL）；細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號為150601-202088，規格為每支60 EU）；Tris緩沖液（批號為2005190，規格為每支4 mL），細菌內毒素檢查（BET）用水（批號為2010100，規格為每支5 mL），均購自湛江安度斯生物有限公司；福州新北生化工業有限公司（批號為19110105，規格為每支5 mL）；甲醇為色譜級。

2 方法與結果

2.1 供試品細菌內毒素限值（L）的確定

美國藥典論壇42（6）InProcess Revision Bortezomib制訂的細菌內毒素限值（L）為應小于16 EU／mg；注射用硼替佐米成人單藥治療推薦劑量為單次1.3 mg／m2，根據2020 年版《中國藥典（四部）》規定，L ＝K ／ M ＝［5 EU／（kg·h）］／ ［1.3 mg／m2×1.62 m2÷（60 kg·h）］＝142 EU／mg，其中K 為機體每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，M 為用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，故原研藥將L 定為應小于25 EU／mg。綜合考慮，將硼替佐米原料藥細菌內毒素的L 確定為16 EU／mg。

2.2 鱟試劑靈敏度復核試驗

按2020 年版《中國藥典（四部）》通則1143 細菌內毒素凝膠檢查法的相關技術要求，選用標示靈敏度為0.25，0.06 EU／mL 的鱟試劑，以BET 用水為陰性對照（NC）進行靈敏度復核試驗。2 個廠家4 批次鱟試劑的靈敏度實測值（λc）均在0.5 λ～2.0 λ 范圍內，符合規定，結果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab.1 Sensitivity checking results of tachypleus amebocyte lysate

2.3 干擾預試驗

凝膠法市售鱟試劑的λ 為0.03～0.5 EU ／ mL，L 為16EU／mg，按最小有效稀釋濃度（MVD）＝λ／ L計算，得供試品有效稀釋質量濃度為0.002 00～0.031 25 mg／mL。選取2 個不同生產廠家標示靈敏度為0.25 EU／mL 的鱟試劑進行干擾預試驗。取3 批樣品，加甲醇溶解，制成質量濃度為12.5 mg ／mL 的供試品溶液，用Tris 緩沖液稀釋至3.125 mg ／mL，再加BET 用水稀釋，分別制得質量濃度為0.031 25，0.015 62，0.007 80，0.003 90，0.002 00 mg／mL 的系列陰性對照（NPC）溶液；同法操作配制一組含2 λ 細菌內毒素的系列陽性對照（PPC）溶液；以含2 λ 即0.50 EU／mL 的細菌內毒素溶液為陽性對照（PC），以BET 用水為陰性對照（NC）。各平行制作2管，每管加樣后混勻，在（37±1）℃的試管恒溫儀中保溫（60±2）min。試驗結果見表2。據此初步判斷，供試品溶液質量濃度在0.003 90 mg／mL 時對不同廠家的鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾。

表2 硼替佐米干擾預試驗結果Tab.2 The pre-interference test results of bortezomib

2.4 正式干擾試驗

根據干擾預試驗結果，取樣品適量，加甲醇制成質量濃度為12.5 mg／mL 的供試品溶液，再依次用Tris 緩沖液、BET 用水稀釋，得質量濃度為0.003 9 mg／mL 的溶液A。將細菌內毒素工作標準品用BET 用水稀釋至0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL，即得內毒素工作標準品系列溶液；用溶液A 將細菌內毒素工作標準品稀釋至0.125，0.060，0.030，0.015 EU／mL，作為供試品A；每個濃度均平行4 管。以BET 用水作NC，平行2 管。通過試驗結果計算出細菌內毒素工作標準品系列溶液的內毒素反應終點濃度（Es）和供試品A 內毒素反應終點濃度（Et）。結果見表3。可見，Es及Et均在0.5 λ～2.0 λ范圍內，表明供試品溶液質量濃度為0.003 9 mg／mL時，對2 個廠家的鱟試劑與細菌內毒素的反應均無明顯干擾。

表3 硼替佐米正式干擾試驗結果Tab.3 The interference test results of bortezomib

2.5 細菌內毒素檢查

取3 批次樣品各適量，按2.2 項下0.003 90 mg／mL NPC 溶液的試驗方法，同時按藥典要求設立PPC 管、NC管和PC 管。取2 個廠家靈敏度為0.06 EU／mL 的鱟試劑進行檢查。結果見表4?？梢姡? 批次樣品中細菌內毒素含量均符合規定。

表4 硼替佐米細菌內毒素檢查結果Tab.4 The bacterial endotoxin test results of bortezomib

3 討論

鱟試劑與內毒素的反應需在水溶液中進行，難溶性藥物可根據自身的溶解性選擇合適的溶劑如二甲基亞砜（DMSO）、乙醇、二氯甲烷等［4-7］進行溶解，然后進行細菌內毒素檢查。硼替佐米在水中幾乎不溶［8］，且高濃度的硼替佐米溶液對鱟試劑與細菌內毒素的凝集反應有干擾［9］。前期研究顯示，3 批樣品的pH 約為5.4。故首先根據硼替佐米的溶解性選擇甲醇溶解，再用Tris 緩沖液調節pH，最后經BET 用水稀釋得檢查用溶液。經上述方法稀釋后，能完全消除各種干擾因素對樣品細菌內毒素檢查的影響，且方法的靈敏度高、可靠性強。本試驗結果顯示，當硼替佐米原料藥的L 確定為16 EU／mg，質量濃度稀釋至0.003 90 mg／mL，選用靈敏度不低于0.06 EU／mL 的鱟試劑進行試驗時，對鱟試劑與細菌內毒素的反應無明顯干擾。

綜上所述，本研究中建立的方法可用于硼替佐米的細菌內毒素檢查。