離子色譜法測定妥布霉素地塞米松滴眼液中依地酸二鈉含量

姚晶晶，匡 釗，丁蘇蘇

（江蘇省揚(yáng)州市食品藥品檢驗檢測中心，江蘇 揚(yáng)州 225001）

妥布霉素地塞米松滴眼液為混懸復(fù)方制劑，具有抗菌作用，主要用于治療眼瞼、球結(jié)膜、角膜及眼球前段組織病變［1］。滴眼液處方中加入依地酸二鈉（EDTA-2Na）作為螯合劑，可增強(qiáng)其穩(wěn)定性［2-4］，但過量使用依地酸二鈉會造成混懸滴眼液結(jié)塊，影響療效。依地酸二鈉的測定方法主要包括衍生化高效液相色譜法和離子色譜法［5-6］。衍生化高效液相色譜法需加入金屬離子絡(luò)合，干擾因素多；而離子色譜法常用于檢測無機(jī)離子和有機(jī)小分子離子，具有操作簡便、靈敏度高、專屬性好、分析準(zhǔn)確可靠等優(yōu)勢，廣泛用于藥物質(zhì)量控制［7-10］。本研究中采用抑制性離子色譜系統(tǒng)測定依地酸二鈉陰離子，為控制妥布霉素地塞米松滴眼液中依地酸二鈉的用量提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo ICS-5000+型離子色譜儀（賽默飛世爾科技＜中國＞公司）；Milli-Q IQ 7000 型超純水系統(tǒng)（德國Merck Millipore 公司）；XS205DU 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為0.01 mg）；KH-400KDB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；ARES 500 型抑制器（4 mm，美國Dionex 公司）。

1.2 試藥

依地酸二鈉對照品（曼哈格檢測技術(shù)股份有限公司，批號為C0006654，含量為99.9%）；妥布霉素地塞米松滴眼液（廠家A，批號分別為190503，190817；廠家B，批號為J 190709；廠家C，批號為19D30BA）；氫氧化鉀溶液（美國Dionex 公司）；苯扎溴銨對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為135051 -201401，含量為10.9 mg／mL）；氯化鈉、亞硫酸二鈉、硫酸鈉、硝酸鉀、磷酸氫二鈉均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

陰離子色譜柱：Dionex IonPacTMAS11-HC 分析柱（250 mm×4 mm）；Dionex IonPacTMAG11-HC 保護(hù)柱（50 mm×4 mm）；淋洗液：含30 mmol／L 的氫氧化鉀溶液；流速：1.0 mL／min；電導(dǎo)檢測器：ASRS-ULTRA 抑制模式，抑制電流為75 mA；檢測池溫度：25 ℃；進(jìn)樣量：25 μL。

2.2 溶液制備

1.EDTA2- 2.Cl- 3.SO32- 4.SO42- 5.Br- 6.NO3- 7.PO43-圖1 系統(tǒng)適用性試驗離子色譜圖1.EDTA2- 2.Cl - 3.SO32- 4.SO42- 5.Br - 6.NO3- 7.PO43-Fig.1 Ion chromatogram of the system suitability test

取依地酸二鈉對照品37.22 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加水定容，即得對照品溶液。精密量取樣品（廠家A）1 mL，置50 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，即得供試品溶液A；精密量取樣品（廠家B、廠家C）各1 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加水定容，搖勻，即得供試品溶液B，C。取氯化鈉29.21 mg，亞硫酸二鈉25.20 mg，硫酸鈉14.17 mg，依地酸二鈉27.22 mg，硝酸鉀20.25 mg，磷酸氫二鈉27.60 mg，精密稱定，分別置25 mL 容量瓶中，加水定容，精密量取上述溶液各0.25 mL，苯扎溴銨對照品0.1 mL，置20 mL 容量瓶中，加水定容，即得質(zhì)量濃度為5～100 mg／L 的系統(tǒng)適用性試驗用混合溶液。以水為空白溶劑。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗和專屬性試驗：取2.2 項下混合溶液25 μL，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果，各陰離子理論板數(shù)均＞2 000，分離度均≥1.5，相互間分離良好，詳見圖1。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相同保留時間處有相應(yīng)峰出現(xiàn)，且空白溶劑對測定結(jié)果無干擾。詳見圖2。

線性關(guān)系考察：取2.2 項下對照品溶液75，100，200 μL 及0.5，1.0，1.5 mL，分別置20 mL 容量瓶中，用水定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度分別為5.58，7.44，14.89，37.22，74.44，111.66mg／L 的系列對照品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以依地酸二鈉質(zhì)量濃度（X，mg／L）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y ＝0.049 6 X-0.005 0（r ＝0.999 9，n ＝6）。結(jié)果 表 明，依 地 酸 二 鈉 質(zhì) 量 濃 度 在5.58～111.66 mg／L 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

1.依地酸二鈉A.空白溶劑 B.對照品溶液 C.供試品溶液圖2 專屬性試驗離子色譜圖1.disodium edetateA.Blank solvent B.Reference solution C.Test solutionFig.2 Ion chromatograms of the specificity test

定量限考察：取依地酸二鈉對照品溶液（質(zhì)量濃度為5.58 mg／L），用水逐級稀釋，并按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比（S／ N）為10 ∶1 時計算定量限。結(jié)果定量限為23.25 ng。

精密度試驗：取2.2 項下對照品溶液，按2.1 項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積。結(jié)果依地酸二鈉峰面積的RSD 為0.84%（n ＝6 ），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2 項下對照品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12，24，48 h 時按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果依地酸二鈉峰面積的RSD 為1.31%（n ＝7），表明對照品溶液在室溫下放置48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為190817）適量，共6 份，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果依地酸二鈉的平均含量為0.968 7 mg／mL，RSD 為1.40%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：精密量取已知含量的樣品（批號為190817）2.5 mL，置100 mL 容量瓶中，共9 份，分別精密加入對照品溶液1.0，1.5，2.0 mL，各3 份，按2.2 項下方法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test（n ＝9）

2.4 樣品含量測定

取4 批樣品各適量，分別按2.2 項下方法制備供試品溶液，再按2.1 項下色譜條件進(jìn)樣測定，每批樣品測定2 份，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果批號為190503，190817，J190709，19D30BA 樣品中依地酸二鈉含量分別為0.876 0，0.968 7，0.257 1，0.120 9 mg／mL。

3 討論

妥布霉素地塞米松滴眼液常見輔料包括依地酸二鈉、氯化鈉、硫酸鈉、苯扎溴銨，考慮到上述輔料中Cl-，Br-，SO42-等離子可能干擾依地酸二鈉含量測定，故本研究中對上述離子進(jìn)行考察。結(jié)果表明，妥布霉素地塞米松滴眼液中其他離子對依地酸二鈉含量測定均無干擾。

依地酸二鈉在離子色譜柱中保留能力弱，選用Dionex IonPacTMAS11-HC 分析柱和氫氧化鉀淋洗液，可使依地酸二鈉較快出峰，為了更好地分離依地酸二鈉與常規(guī)陰離子，本研究中在1.0～1.5 mL／min 范圍內(nèi)改變淋洗液流速，考察流速對依地酸二鈉含量測定的影響。結(jié)果，流速變化對依地酸二鈉與其他離子的分離度影響不明顯；再將淋洗液氫氧化鉀質(zhì)量濃度從20 mmol／L調(diào)至30 mmol／L，使各陰離子間的分離度得到了改善。依地酸二鈉在工藝處方中常用作穩(wěn)定劑［11-13］，可提高藥物的穩(wěn)定性，但不同廠家的用量差異較大，依地酸二鈉的安全用量有待進(jìn)一步研究。