八珍湯治療胃癌的網(wǎng)絡藥理學作用機制*

趙培西，唐仕浩，趙 華，趙 斌，張 艷，楊鐵林，郭 燕△，張一力

（1.陜西省腫瘤醫(yī)院，陜西 西安 710061；2.西安交通大學生命科學與技術學院·生物醫(yī)學信息工程教育部重點實驗室，陜西 西安 710049）

胃癌是全球第五大癌癥，每年超100 萬患者確診［1］。東亞是胃癌患者集中的地區(qū)之一［2］。胃癌的治療以手術為主，術后或不適合手術的患者也可采用藥物治療，對胃癌有效的化學治療（簡稱化療）藥物包括氟嘧啶類、鉑類、紫杉烷類和伊立替康［2］。但西藥常伴各種藥品不良反應，如卡培他濱會導致手足綜合征［3］，奧沙利鉑與精神類疾病和腹瀉相關［4］。中藥具有抑制癌細胞增殖或誘導其凋亡的作用［5-7］，且藥性溫和，藥品不良反應較少，逐漸受到大眾重視。八珍湯別名八珍散，載于多本醫(yī)方著作，其由人參、白術、白茯苓、當歸、川芎、白芍、熟地黃、甘草組方，對胃癌有一定療效［8-10］，但因該方成分多樣、作用靶點繁復，具體機制仍未明確。網(wǎng)絡藥理學可通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”網(wǎng)絡，系統(tǒng)、完整地揭示中藥治療疾病的作用機制。本研究中探討了八珍湯治療胃癌的網(wǎng)絡藥理學作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 活性成分篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP）上，分別以“人參”“白術”“茯苓”“當歸”“川芎”“白芍”“熟地黃”“甘草”為關鍵詞進行搜索，篩選條件為藥物口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18。將得到的靶點在Uniprot 網(wǎng)站（https：／ ／www.uniprot.org／）中轉(zhuǎn)換為對應ID，同時排除部分指代不明或非“Homo sapiens”的靶點。

1.2 作用靶點預測及生物活性成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

預測篩選后的黃芪主要生物活性成分的作用靶點，根據(jù)TCMSP 提供的靶點，利用網(wǎng)絡繪圖軟件Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建主要生物活性成分-靶點的作用網(wǎng)絡。

1.3 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建與分析

構(gòu)建藥物直接靶點與其他蛋白間的PPI 網(wǎng)絡，通過String 數(shù)據(jù)庫對藥物靶點及疾病靶點進行PPI 分析，篩選條件為互作分數(shù)大于0.9。

1.4 目標基因富集分析

京都基因與基因組百科全書（KEGG）是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫，有助于研究者把基因及表達信息作為一個整體網(wǎng)絡進行研究。通過KEGG富集分析得到相關的代謝通路。使用metascape 網(wǎng)站（https：／ ／metascape.org／），Min Overlap 選擇3，P 值選擇0.01，MinEnrichment 選擇1.5，進行在線KEGG 通路分析。

基因本體論（GO）分析中將基因功能分成生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）三部分。將上一步得到的所有靶點作為輸入，使用David6.8（https：／ ／david.ncifcrf.gov ／ ）在線功能注釋工具進行GO 富集分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分檢索

得復方八珍湯組方中各中藥的主要成分150 種，其中人參22 種、白術7 種、茯苓15 種、當歸2 種、川芎7 種、白芍13 種、熟地黃2 種、甘草92 種。

2.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡構(gòu)建

得到8 種中藥的對應作用靶點，與2.1 項下篩選得到主要成分進行匹配，在Uniprot 網(wǎng)站中對對應靶點進行檢索，選擇物種“Homo sapiens”，排除重復的和指代不明的靶點后，得到238 個靶點，共計2 035 個對應關系（圖1）。其中“共有”表示該成分在多種中藥中均存在，當歸和熟地無特有成分，故未單獨標出。

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡示意圖Fig.1 Schematic diagram of active ingredient-target network

2.3 PPI 分析

篩選互作分數(shù)大于0.9 的PPI pairs，238 個藥效分子靶點基因中有230 個與4 968 個疾病靶點間有相互作用，這種作用關系達22 795 個。其中，按degree 值排序排名前15的蛋白為TP53（590），MAPK1（532），CDC42（504），MAPK3（451），HSP90AA1（409），AKT1（404），JUN（387），CHRM2（380），STAT3（376），CXCL8（370），RELA（365），EGFR（361），MAPK14（336），CCNB1（327），APOB（324）。

2.4 KEGG 通路與GO 富集分析

將KEGG 分析到的通路按P 值由小到大排列，選取前20 位進行可視化，結(jié)果見圖2。八珍湯對應靶點與癌癥通路富集結(jié)果顯著性最強，同時與MAPK 通路、cAMP 通路等細胞增殖分化和凋亡過程相關。以癌癥通路為例，可觀察到在PPI 網(wǎng)絡中排名靠前的均在該通路中被富集，如TP53，MAPK1 和MAPK3（圖中ERK），CDC42，HSP90AA1（圖中HSP）等，詳見圖3。以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05 為界篩選FDR 最小的10 條通路進行GO 富集分析，結(jié)果見圖4。表明八珍湯作用靶點與癌癥通路高度相關。

圖2 KEGG 通路分析結(jié)果Fig.2 Results of KEGG pathway analysis

圖3 癌癥通路示意圖Fig.3 Schematic diagram of cancer pathways

圖4 GO 富集分析結(jié)果Fig.4 Results of GO enrichment analysis

2.5 PPI 網(wǎng)絡主要模塊分析

利用cytoscape 軟件中MCODE 插件對2.3 項下得到的PPI 網(wǎng)絡進行模塊分析，degree cutoff 選擇3，其他參數(shù)默認，最終得到16 個主要模塊，其中得分大于5 的有模塊A（6.189 分，含75 個蛋白）和模塊B（6.036 分，含221 個蛋白）。

為進一步探究模塊中蛋白的功能，進行KEGG 通路分析，按顯著性排序繪圖，結(jié)果圖6。其中與總體KEGG 分析結(jié)果相比，在腫瘤及細胞增殖周期相關的通路同樣在這里得到了富集。

3 討論

A.模塊A B.模塊B圖5 PPI 主要模塊分析A.Module A B.Module BFig.5 Analysis of PPI main modules

本研究中初步篩選出八珍湯活性成分150 個，繼而挖掘出238 個靶點基因及相互作用關系2 035 個，表明中藥復方作用機制具有多靶點、多途徑的特點。PPI 分析所得degree 前15 名蛋白多與胃癌相關，以排名前3的蛋白為例：TP53 是由抑癌基因TP53 編碼的［11］，與腫瘤形成密切相關；有研究表明，胃癌患者的MAPK1 水平顯著上升，同時抑制MAPK1 的表達水平會抑制胃癌細胞的增殖［12］，CDC42 蛋白屬細胞分裂周期蛋白，可激活下游MAPK／ERK 通路、PI3K／AKT 通路和PTEN 通路，在胃癌的細胞增殖、細胞周期、凋亡、遷移和侵襲中發(fā)揮著關鍵作用［13］。同時，這3 種蛋白都是槲皮素的靶點，槲皮素在八珍湯中是甘草的特有成分，已有甘草提取物能抑制胃癌細胞增殖并促進其凋亡的報道［14］。KEGG 通路分析中也得到了類似結(jié)果，除與腫瘤形成和轉(zhuǎn)錄直接相關的通路外，細胞生長凋亡及信號傳導的相關通路如MAPK 通路、cAMP 通路［15］、AMPK 通路［16］也得到類似顯著結(jié)果。這些通路均被證實在胃癌形成或治療過程中的作用，證明了本研究與生物醫(yī)學研究可相互印證。GO 富集分析中，細胞對藥物等的反應在BP 中排名靠前，說明這些蛋白主要參與細胞基礎活動，同時對內(nèi)源性刺激應答進行調(diào)控；MF 分析表明，這些靶點主要參與酶、蛋白、轉(zhuǎn)錄因子和藥物結(jié)合過程；CC 分析顯示，它們與細胞間質(zhì)和細胞質(zhì)相關的通路有關。

A.模塊A B.模塊B圖6 PPI 主要模塊蛋白KEGG 通路分析結(jié)果A.Module A B.Module BFig.6 Results of KEGG pathway analysis of PPI main module protein

綜上所述，基于網(wǎng)絡藥理學和生物信息學分析能揭示八珍湯在抗胃癌過程中可能的機制，并找到關鍵靶蛋白，為后續(xù)研究提供重要的理論依據(jù)，也為藥物作用機制的研究和藥物研發(fā)提供了新思路和新方法。