蕁麻根質量標志物研究

陳 艷，李曉波，賈祎萍，胡 海，王夢月

上海交通大學藥學院，上海 200240

蕁麻根為蕁麻科植物蕁麻UrticafissaPritz、寬葉蕁麻U.laetevirensMaxim.、狹葉蕁麻U.angustifoliaFisch.et Hornem.、麻葉蕁麻U.cannabinaL.等的干燥根。具有祛風，活血，止痛之功效，常用于風濕、類風濕、蕁麻疹、濕疹，但缺乏質量評價指標研究[1,2]。因此，蕁麻根的質量標志物研究具有重要意義。

前期的化學成分研究表明，裂環木脂素為蕁麻根特征性成分[3-7]。其中，蕁麻醇-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(簡稱蕁麻醇苷，見圖1)為主要裂環木脂素成分[3,6]。本文對蕁麻醇苷的生物活性進行了研究，發現其具有明顯的抗炎、抗氧化、抗補體作用，可以作為蕁麻質量標志物；接著，對蕁麻醇苷的波譜特征進行了較系統研究，補充了UV、IR、CD、NMR等波譜數據；最后，建立了蕁麻醇苷的HPLC測定方法，為蕁麻根的質量評價提供了科學依據。

圖1 蕁麻醇苷結構式Fig.1 The chemical structure of urticoside

1 實驗材料

1.1 實驗材料

蕁麻根采自四川、重慶、云南、新疆、廣西，均經王夢月副教授鑒定，憑證標本(UR1～UT19)保存于上海交通大學藥學院。

1.2 藥品及試劑

蕁麻醇苷(自制，經HPLC分析純度為98.8%)；RAW 264.7細胞株(中國科學院上海細胞庫)；甲醇、乙醇、正丁醇、二氯甲烷(分析純，上海凌峰)；乙腈、甲醇(色譜純，上海百靈威)；肝素鈉、地塞米松(國藥集團)；MTT、LPS(Sigma)；RPMI 1640 培養基、DPPH、trolox(北京伊諾凱)；NO、IL-1、TNF-α、ABTS及FRAP試劑盒(南京建成)；豚鼠血清、綿羊紅細胞(SRBC)購自上海生物工程公司；薄層層析硅膠G板、柱色譜用硅膠(200～300目，青島海洋)；凝膠Sephadex LH-20(瑞士Amersham Pharmacia)；ODS 反相硅膠(40～63 μm，德國默克)；超純水(美國Millipore)。

1.3 實驗儀器

Bruker AVANCE 700 MHz核磁共振儀(德國Bruker，配有5 mm1H/13C/15N超低溫探頭)。Agilent 1200分析型高效液相色譜儀(美國Agilent)，配有自動進樣器、DAD檢測器、Shim-pack VP-ODS色譜柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；EYELA N-101型旋轉蒸發儀(東京理化)； DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒)；BS300S型電子天平(北京賽多利斯)；Varioskan LUX 酶標儀(美國賽默飛)；Agilent 1290 UPLC-Q-TOF 質譜聯用儀(美國 Agilent)；Nicolet 6700 傅里葉紅外光譜儀(美國Thermo Fisher)；P-2000型全自動數字旋光儀、J-1500多功能圓二色譜儀(日本JASCO)。

2 實驗方法

2.1 蕁麻醇苷的生物活性

樣品分別用RPMI 1640培養基(用于抗炎活性測試)、5%甲醇溶解(用于抗氧化、抗補體活性測定)，配成0.2、1.0、5.0、20.0、100、500 μM溶液。

2.1.1 抗炎活性測定

2.1.1.1 細胞毒考察

用0.25%胰酶消化對數生長期的RAW 264.7細胞，以培養液稀釋為1×105個/mL的單細胞懸液，每孔100 μL接種于96孔培養板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中過夜，待細胞貼壁后加入各濃度藥液100 μL，MTT法考察樣品的細胞毒性。

2.1.1.2 炎癥因子測定

RAW 264.7 細胞懸液接種96孔板，每孔100 μL，細胞數為1×105個/mL，培養24 h后，吸出培養基。加入LPS，使各組LPS終濃度為5 μg/mL。分別加入各濃度的藥液100 μL，繼續培養24 h，試劑盒檢測上清NO、IL-1、TNF-α釋放量，計算不同濃度樣品的抑制率及半數抑制濃度(IC50)[8]。

2.1.2 抗氧化作用

2.1.2.1 清除DPPH活性測定

不同濃度的樣品加入適量的DPPH甲醇溶液，混勻后避光放置30 min 后于517 nm 下測定吸光度(A)。同時，設置空白組(以等體積的甲醇代替DPPH溶液)和對照組(以等體積的甲醇代替樣品)，并以trolox代替供試品作為陽性對照組。計算不同濃度樣品的DPPH清除率(清除率=[1-(A供試品-A空白)/A對照]× 100%)及半數清除濃度(EC50)。

2.1.2.2 清除ABTS活性測定

ABTS自由基清除活性測定參照試劑盒使用方法。配制過氧化氫溶液和過氧化物酶、ABTS工作液，取適量過氧化物酶工作液與不同濃度樣品輕輕混勻，再加入適量ABTS工作液混勻，室溫孵育6 min后在414 nm下測定A值。同時設置空白對照組(以等體積甲醇代替樣品)，以trolox為陽性對照。計算不同濃度樣品的ABTS清除率及EC50[9]。

2.1.3 抗補體作用

2.1.3.1 經典途徑

樣品用BBS 緩沖液稀釋，加入臨界濃度的補體(1∶80稀釋的豚鼠血清)、溶血素、2% SRBC。37 ℃水浴30 min，離心后取上清液在405 nm下測定A值。同時，設置對照組(等量的供試品加入BBS 緩沖液中，用于測定本底A 值)、補體組(臨界濃度的補體直接加入BBS 緩沖液、溶血素和2% SRBC，用于測定臨界濃度補體所造成紅細胞溶血的A 值)、全溶血組(2% SRBC加入水中使之全溶血，用于觀察補體組是否達到或接近全溶血水平)、陽性對照組。計算不同濃度樣品的溶血抑制率(溶血抑制率=[1-(A樣品-A對照)/A全溶血] × 100%)及CH50(經典途徑50%抑制溶血所需供試品濃度)。

2.1.3.2 旁路途徑

取臨界濃度的補體(1∶4稀釋的人血清)分別與不同濃度的樣品混勻，加入適量的AP緩沖液和0.5%兔紅細胞。37 ℃水浴30 min，離心后取上清液在405 nm下測定A。同時設置對照組、補體組、全溶血組、陽性對照組。計算不同濃度樣品的溶血抑制率及AP50(旁路途徑50%抑制溶血所需濃度)[10]。

2.2 蕁麻醇苷的波譜特征

2.2.1 旋光度

取樣品10.0 mg，溶于1.0 mL甲醇，采用旋光儀測定，測定波長589 nm。

2.2.2 紫外、CD光譜

樣品分別用甲醇、無水乙醇、乙腈溶解，配成0.05 mg/mL溶液。紫外分光光度計記錄樣品紫外吸收曲線，并計算摩爾吸收系數；ECD 光譜儀測定CD譜。

2.2.3 紅外光譜

溴化鉀壓片，用紅外光譜儀在4 000 ～ 600 cm-1的波數范圍內掃描，繪制紅外圖譜。

2.2.4 質譜

樣品溶于甲醇，采用Agilent 1290 UPLC-Q-TOF-MS進行測定，正離子模式檢測。

2.2.5 NMR譜

樣品4.0 mg加入0.5 mL DMSO-d6，在Bruker 700 MHz NMR儀上測定1H譜、13C譜及二維譜(HSQC、1H-1H COSY、HMBC、NOESY)。

另取樣品4.0 mg，分別加入0.5 mL CD3OD、C5D5N、Acetone-d6，在Bruker 700 NMR儀上測定1H譜、13C譜及二維譜(HSQC、1H-1H COSY、HMBC)。

2.3 蕁麻醇苷的HPLC測定

2.3.1 供試品溶液的制備

取樣品粉末約2 g，精密稱定，置100 mL圓底燒瓶中，加入50 mL甲醇，80 ℃水浴回流提取2次，每次1 h，濾過，合并濾液，蒸干，殘渣加甲醇溶解、定容至25 mL，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.3.2 對照品溶液的制備

取蕁麻醇苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蕁麻醇苷0.285 mg的溶液。

2.3.3 色譜條件及系統適用性試驗

甲醇(A)-水(B)為流動相，洗脫程序為：0～10 min 10%A、10～20 min 10%A→35%A、20～50 min 35%A→40%A；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2.3.4 線性關系考察

將濃度為0.285 mg/mL的蕁麻醇苷溶液分別稀釋2倍、10倍、20倍、80倍得到不同濃度的對照品溶液，按“2.3.3”項進樣分析。以色譜峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，進行線性回歸。

2.3.5 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，按“2.3.3”項連續進樣6次，測定色譜峰峰面積。

2.3.6 穩定性考察

取樣品粉末約2 g，精密稱定，按2.3.1項制備供試品溶液，按“2.3.3”項色譜條件，分別于0、2、4、6、8、10、12、16、24 h各進樣10 μL，記錄色譜峰面積。

2.3.7 重復性試驗

取同一批次蕁麻粉末6份，每份約2 g，精密稱定，按“2.3.1”項制備供試品溶液，按“2.3.3”項進樣分析，記錄色譜峰面積。

2.3.8 加樣回收率試驗

精密取已知蕁麻醇苷含量的樣品6份，每份約1 g，精密稱定，加入蕁麻醇苷對照品溶液，按“2.3.1”方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項進樣分析，計算回收率。

3 實驗結果

3.1 蕁麻醇苷的生物活性

對蕁麻醇苷進行了抗炎、抗補體、抗氧化活性評價。結果發現：蕁麻醇苷對RAW 264.7細胞沒有明顯的毒性，濃度達250 μM時，細胞存活率超過91.3%；蕁麻醇苷具有較強的抗炎作用，能明顯抑制LPS誘導RAW 264.7細胞釋放NO、IL-1、TNF-α等炎癥介子(半數抑制濃度均低于16 μM)；蕁麻醇苷能顯著清除DPPH、ABTS等自由基，其作用與陽性對照trolox相當，顯示出良好的抗氧化作用；蕁麻醇苷還具有良好的抗補體活性，對經典途徑和旁路途徑均有作用(見圖2)。上述結果表明蕁麻醇苷具有與蕁麻根抗風濕作用直接相關的生物活性，可作為蕁麻質量評價指標。

圖2 蕁麻醇苷生物活性Fig.2 The biological activities of urticoside

3.2 蕁麻醇苷的波譜特征

3.2.1 旋光度

3.2.2 紫外光譜

樣品用3種溶劑測試，結果如下UV(MeOH)λmax(ε)：235(10 070)，280(5 061)nm；UV(MeOH)λmax(ε)：236(8 835)，284(4 458)；UV(MeOH)λmax(ε)：235(6 378)，280(3 341)。在282、240 nm左右處均顯示出取代苯環的特征吸收峰。進一步比較甲醇、無水乙醇、乙腈中測試的結果，發現測試溶劑對最大吸收波長及摩爾吸收系數有明顯影響。

3.2.3 紅外光譜

樣品在3 414 cm-1處有一寬強峰，為羥基伸縮振動峰。在2 918 cm-1處的吸收峰為亞甲基伸縮振動峰。在2 850、1 271 cm-1處分別有一尖峰、強峰，說明含有-OCH3，且-OCH3與苯環相連。1 751 cm-1處的強峰為飽和γ-飽和內酯中羰基的特征吸收峰。在1 515 cm-1處有明顯吸收峰，為芳環特征峰。此外，樣品在1 047、1 003 cm-1均有寬強峰，說明含有仲醇、叔醇結構。

3.2.4 質譜

HR-ESI-MS正離子模式給出準分子離子峰m/z554.223 1 [M + NH4]+(calcd for C26H36NO12，554.223 8)；此外，還在m/z1 095.368 1處出現[2M + Na]+峰(calcd.for C52H64O24Na，1 095.368 5)。

3.2.5 圓二色譜

樣品甲醇溶液在237、286 nm處均呈正Cotton效應(圖3)，與(3S，4R)蕁麻醇-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷高斯計算結果一致。

圖3 蕁麻醇苷CD圖Fig.3 The CD spectrum of urticoside

3.2.6 核磁共振譜

樣品1H NMR(DMSO-d6，700 MHz)中出現32個氫信號，其中：芳氫6個、6個活潑氫、2個甲氧基質子；H-3和H-4之間較小的偶合常數(J< 7.0 Hz)提示C-3和C-4是反式連接。NOESY譜中未觀察到H-3 和H-4之間的相關峰，進一步表明C-3和C-4是反式連接。端基質子(H-1′′′)的偶合常數(J> 7.0 Hz)，提示葡萄糖為β構型。13C NMR(DMSO-d6，175 MHz)中出現26個碳信號(其中，C-4信號與溶劑重疊；葡萄糖基6個)。根據HMBC、HSQC、1H-1H COSY、NOESY等二維譜，核磁數據歸屬結果見表1、表2。

表1 測試溶劑對蕁麻醇苷 13C NMR的影響(175 MHz)

進一步比較了不同溶劑對1H、13C NMR譜的影響，結果表明：不同溶劑對13C NMR譜有明顯影響，部分碳化學位移相差2以上，如：羰基碳(C-2)在氘代甲醇和氘代丙酮中相差2.5 ppm；糖基上的6個碳在氘代吡啶和氘代DMSO-d6中均相差2 ppm以上(見表1)。相對于碳譜，不同溶劑對1H NMR譜影響更大，不僅影響偶合常數，且顯著影響非芳環質子的化學位移(這些質子在DMSO-d6和C5D5N中化學位移甚至相差0.8 ppm以上(見表2)。

表2 測試溶劑對蕁麻醇苷的1H NMR影響(700 MHz)

續表2(Continued Tab.2)

3.3 HPLC含量測定

3.3.1色譜條件及系統適用性試驗

對照品和代表性供試品溶液的HPLC色譜圖見圖4，顯示色譜條件及系統適用性試驗結果良好。

圖4 對照品(A)及樣品(B)HPLC圖Fig.4 HPLC chromatograms of reference (A) and Urticae Rhizomae (B)

3.3.2 線性關系考察

蕁麻醇苷在3.562 5×10-3～ 0.285 mg/mL線性關系良好，回歸方程為Y= 34.96X-15.09(r2= 0.999 6)。

3.3.3 精密度試驗

精密吸取同一對照品溶液，連續進樣6次，結果峰面積的RSD為0.87%，表明精密度良好。

3.3.4 穩定性考察

結果蕁麻醇苷峰面積的RSD為1.80%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.3.5 重復性試驗

結果蕁麻醇苷峰面積的RSD為0.85%，表明重復性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗

平均回收率為103.72%，RSD值為1.6%，表明該方法準確度良好(見表3)。

表3 加樣回收率結果(n = 6)

3.3.7 樣品測定結果

不同品種的蕁麻根中蕁麻醇苷含量有明顯差異。所測定樣品，麻葉蕁麻根的含量明顯高于其他品種。同一品種不同產地，蕁麻醇苷的含量也有明顯差異。蕁麻科蝎子草屬植物蝎子草Girardiniasuborbiculata在四川、云南等地亦作蕁麻藥用，但未檢出蕁麻醇苷(見表4)。結果表明蕁麻醇苷可作為蕁麻根質量評價的標志物。

表4 蕁麻醇苷含量測定結果

4 討論與結論

風濕關節炎、類風濕關節炎為常見疾病，其發病機理不清，現代研究表明多與炎癥介質釋放、補體過度激活、氧化應激損傷有關。蕁麻根為常用民族藥，在漢、藏、彝、苗、羌、土家、布依、維吾爾、瑤、傈僳、納西族等11個民族藥用，用于治療風濕關節炎、類風濕關節炎，療效確定，安全無毒。但其質量標志物研究未見報道。

蕁麻根主要成分為1，7-裂環木脂素類成分。該類成分分布局限，是蕁麻的特征性成分。其中，蕁麻醇苷是蕁麻的主要成分。本文根據蕁麻根治療風濕、類風濕的傳統功效，對其進行了抗炎、抗補體、抗氧化等相關活性研究。結果發現蕁麻醇苷具有顯著的抗炎、抗氧化、抗補體，為蕁麻根的主要活性成分及特征性成分，可以作為蕁麻質量標志物。

在此基礎上，本論文對其進行了較系統的波譜研究。首次對蕁麻醇苷UV、IR、CD進行了研究，補充了相關波譜數據，考察了不同測試溶劑對NMR、UV的影響，發現不同溶劑對NMR、UV均有顯著影響。

最后，論文對蕁麻醇苷的HPLC測定方法進行了研究，建立的測定方法簡便、快速、靈敏。不同品種、不同產地的蕁麻根含量差異明顯，結果進一步表明蕁麻醇苷可以用于蕁麻根的質量評價。

致謝：上海交通大學分析測試中心代博娜博士完成NMR測試。