基于網絡藥理學及分子對接技術分析“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對治療銀屑病的作用機制

沈樂樂，席建元，孫立新，王子加，劉均瑜，李 靜

1寧夏醫科大學，銀川 750004；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 410000；3湖南中醫藥大學，長沙 410208

銀屑病，俗稱“牛皮癬、干癬”，臨床常表現為紅色丘疹或斑塊，并覆有銀白色鱗屑或薄膜，點狀出亦為本病的臨床特征，其組織學特征是表皮角質形成細胞過度增殖和異常分化[1]。銀屑病是具有損容性，資料顯示，我國銀屑病患病率約0.47%，該病的機制尚不明確，主要與樹突細胞、T淋巴細胞和角質形成細胞的關系密切[2]，銀屑病的治療從局部光療到全身藥物的組合療法使用，建立了廣泛的常規醫學療法，然而大多數療效有限，且諸多副作用，包括皮膚萎縮，器官毒性，致癌性和免疫抑制，使其治療陷入困境[3]。中醫治療銀屑病具有獨特優勢，可顯著降低復發率，療效明確。

銀屑平丸是湖南中醫藥大學第一附屬醫院皮膚科的院內制劑，諸多臨床案例證實了其治療銀屑病療效確切[4]，其中“半邊蓮-白花蛇舌草”是其主要藥對，半邊蓮味苦、性辛、寒，具有清熱解毒、化瘀止血、利尿之效；白花蛇舌草味甘、性微苦、寒，可清熱解毒、散瘀消癰。二者配伍，相須為用[5]，為探求其干預銀屑病的作用機制，傳統的中醫機理研究大多遵循“一藥一靶一病”的模式，不能反映中藥多成分、多靶點、多途徑的干預特點。網絡藥理學是結合多種藥代動力學參數進行活性化合物預測，不同藥物靶標的挖掘和宏觀角度的網絡分析來預測藥物成分靶點及作用的信號通路，符合中醫藥干預疾病的模式[6]。本研究利用網絡藥理學，對“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對治療銀屑病的潛在機制預測分析，為今后銀屑病的實驗研究及診治思路提供參考。

1 資料及方法

1.1 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對活性化合物成分篩選

運用中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)收集“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對活性化合物成分，口服藥物在血流中的分布程度，是口服藥物發現和臨床應用的最必要前提之一，用于評估藥物數據庫中化合物與臨床治療藥物的結構相似性[13]。因此設置篩條件為：口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18，來篩選藥對的活性成分。

1.2 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對基因靶點篩選

運用TCMSP平臺收集藥物活性靶點，利用Perl腳本獲得藥物有效成分-基因靶點文件。利用UniProt(http://www.uniprot.org/)數據庫轉換成對應的基因名稱。

1.3 銀屑病相關靶基因篩選

在GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫中，以“psoriasis”為關鍵詞檢索銀屑病相關靶基因，設定分數(score)值大于該疾病score值的中位數為疾病靶點的篩選標準獲取銀屑病靶標基因后，與“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對活性化合物的靶向基因交集，所得基因為藥對-疾病交集靶基因。

1.4 構建“藥物活性成分-交集靶標”網絡

將“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對的活性成分與其治療銀屑病的潛在作用靶標關系導入Cytoscape 3.6.1，構建“藥物活性成分-交集靶標”網絡圖。

1.5 構建交集靶基因蛋白互作網絡(PPI)及獲取其核心基因

STRING數據庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)是一個分析蛋白間相互作用及提供蛋白互作可視化的數據庫[7]。利用該數據庫對藥物-疾病交集靶基因進行蛋白互作分析，Organism設置為“Homo sapiens”，獲得蛋白互作網絡圖，并將其可視化，計算平均度值(DC)，以大于兩倍該值設定為核心靶蛋白[8]。

1.6 基因本體論(GO分析)及KEGG通路富集分析

運用R語言將藥對-疾病交集靶基因轉換為相應的ID，再次運行R語言程序，得到GO功能富集、KEGG通路富集分析的氣泡圖及柱狀圖，并以P值<0.05進行篩選排序。

1.7 分子模擬對接驗證

利用分子對接軟件SYBYL-X 2.1.1中的Surflex-dock模塊進行模擬驗證，去除水分子，修復蛋白殘基、側鏈固定和氫化，以“半邊蓮-白花蛇舌草”中核心化合物為配體，銀屑病核心靶蛋白為受體，該對接工具匹配方法主要基于結構及形狀的相似性，有高準確性、高陽性率及匹配速度迅速的特征。一般認為，受體與配體的自由結合能越小，其穩定性越強，則total score值越大。Total score≥5.0意味著配體與靶蛋白之結合活性較優，而total score≥7.0則可預測該配體分子與靶蛋白結合活性較為強烈[9]。

2 結果

2.1 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對活性化合物

將參考值設定為OB≥30%和DL≥0.18，篩選化學成分。結果表明，“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對共有24個活性成分滿足參考值，其中半邊蓮17個，白花蛇舌草7個，結果見表1。

表1 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對活性成分

2.2 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對及銀屑病疾病靶點網絡圖

在GeneCards數據庫中，得到銀屑病疾病共3 760個靶點，并將“半邊蓮-白花蛇舌草”藥物中的24種活性成分對應的靶點(其中半邊蓮415個，白花蛇舌草256個)進行匹配，得到交集靶標121個，韋恩圖如圖1所示。運用Cytoscape 3.6.1軟件構建活性成分-靶點網絡圖，結果見圖2，在大于其平均值兩倍的有效活性成分有6個，分別是槲皮素、木犀草素、山奈酚、刺槐素、β谷甾醇、環三烯酚，提示其為該網絡的關鍵性有效活性成分，在“半邊蓮-白花蛇舌草”干預銀屑病的過程中重要作用。

圖1 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對與銀屑病疾病靶點的交集基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of the intersection gene of the drug “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba” with the target of psoriasis

圖2 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對干預銀屑病的“藥物活性成分-交集靶標”網絡Fig.2 Drug active ingredient-intersecting target network of “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba” in the treatment of psoriasis注：網絡中節點數目為138個，邊為267個，平均度值為：6.1。圖中綠色圓形為交集靶基因；三角形為藥對的活性成分；紅色三角形代表白花蛇舌草特有的化學成分；粉紅色三角形代表半邊蓮特有的活性成分；藍色三角形為共同的活性成分。Note:The number of nodes in the network is 138,the edge is 267,and the average value is 6.1.The green circle is the intersection target gene;the triangle is the active component of the drug pair;the red triangle represents the unique chemical component of the Hedyotis Herba;the pink triangle represents the unique active component of the Lobeliae Chinensis Herba;the blue triangle is the common active component.

2.3 蛋白網絡互作結果及核心靶蛋白提取結果

由圖3A可知，PPI網絡包含109個靶蛋白節點(已剔除未參與蛋白相互作用的相關靶蛋白)，442條相互作用連線，PPI濃縮P值<1.0e-16，網絡的平均度值為8.2，大于該值2倍的核心靶蛋白進行可視化，得到圖3B，可知AKT1、JUN、MAPK1、RELA、HSP90AA1、IL6、ESR1、MAPK8、EGFR、MAPK14是“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對治療銀屑病的關鍵蛋白靶點。

圖3 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對作用銀屑病的PPI網絡及核心靶蛋白Fig.3 PPI network and core target protein of “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba” on psoriasis注：A為“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對干預銀屑病的PPI蛋白互作網絡圖，圖中節點表示共有靶蛋白，節點的度值與顏色深淺及節點面積呈正相關；B為PPI核心靶蛋白度值柱狀圖。Note:A is the network diagram of PPI protein interaction on psoriasis intervention,the nodes in the graph represent common target proteins,and the values of nodes are positively correlated with color depth and node area;B is the PPI core target protein degree histogram.

圖4 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對作用銀屑病的核心靶蛋白的GO富集分析Fig.4 GO Enrichment Analysis of Core Target Protein of Psoriasis by “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba”注：圖中不同顏色的節點表示GO的不同生物學類型；節點上的數值表示該生物學途徑所富集的靶基因的數目。Note:The different coloured nodes in the graph indicate the different biological types of GO;The values on the nodes indicate the number of target genes enriched by that biological pathway.

2.4 GO與KEGG富集分析

根據P值的大小，本研究用棒棒糖圖列舉了各類排名靠前5的GO富集分析結果，如圖4所示，其中生物過程(BP)2 110個，主要涉及對脂多糖、細菌來源反應、化學壓力、活性氧刺激以及氧化應激等多種生物學途徑；涉及細胞組成(CC)47個，主要涉及膜筏、膜微結構域、隔膜區、囊泡性管腔、分泌性顆粒狀管腔等多種細胞結構；包括分子功能(MF)171個，主要涉及DNA結合轉錄因子、細胞因子受體、泛素樣蛋白連接酶結合、細胞因子的活性、泛素蛋白連接酶結合等。

KEGG富集結果篩選得到156條主要信號通路，主要涉及PI3K-Akt、腫瘤壞死因子(TNF)通路、IL-17、Th17細胞分化、VEGF相關信號通路、Th1和Th2細胞分化、B細胞受體、HIF-1α等信號通路，與血管生成、炎性反應、免疫介導等途徑關系密切(見圖5)。

圖5 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對作用銀屑病的核心靶蛋白的KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of core target protein of psoriasis by “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba”注：圖中節點表示KEGG信號通路類型；其節點的顏色越紅則富集顯著性越強；而面積越大則富集基因的數目越多。Note:The nodes in the graph represent the type of KEGG signal pathway.The redder the nodes,the stronger the enrichment significance,and the larger the area,the more the number of enriched genes.

2.5 “半邊蓮-白花蛇舌草”藥對核心化合物作用銀屑病靶蛋白的分子對接驗證

從PubChem數據庫中提取“半邊蓮-白花蛇舌草”中的關鍵有效活性成分作為配體，從Protein Data Bank數據庫提取PPI中的核心靶蛋白作為受體進行分子對接，對接total score結果如圖6所示，在60個對接結果中，30個提示有較優的(total score≥5.0)對接活性，3個有強烈的匹配活性(total score≥7.0)，其中槲皮素與核心靶蛋白結合情況最佳，HSP90AA1是“半邊蓮-白花蛇舌草”中關鍵化學成分結合活性最優的靶蛋白。

圖6 “半邊蓮-白花蛇舌草”中的關鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接Total Score值熱圖Fig.6 Heat map of the key active compounds in the PPI core target protein “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba” Total Score docking with PPI core target protein molecules注：熱圖中橫軸代表“半邊蓮-白花蛇舌草”的有效活性成分配體；縱軸表示PPI核心靶蛋白受體，各數值表示分子對接的Total Score分數，顏色越深表示分數越高。Note:In the heat map,the transverse axis represents the active component ligand of “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba”;The longitudinal axis represents the PPI core target protein receptor,and each value represents the total score fraction of molecular docking,the darker the color,the higher the fraction.

Total score值最高的四組對接情況在如圖7所示，HSP90AA1受體蛋白與β-谷甾醇(total score：8.03，與氨基酸殘基A/LYS58有1個氫鍵聯系)，如圖7A所示。β-谷甾醇與MAPK1受體蛋白(total score：7.44，與氨基酸殘基A/ASP149有1個氫鍵聯系)，如圖7B所示。MAPK8受體蛋白與木犀草素(total score：7.20，與氨基酸殘基A/GLU109、A/LYS55、A/ARG69、A/GLN37、A/MET111有5個氫鍵聯系)，如圖7C所示。山奈酚與HSP90AA1受體蛋白(total score：7.02，與氨基酸殘基A/GLY97、A/ASP93、A/ASN51有3個氫鍵聯系)，如圖7D所示。并且上述配體化合物均能良好的包埋在直徑為5A的受體靶蛋白的活性口袋中。

圖7 “半邊蓮-白花蛇舌草”中關鍵活性化合物與PPI核心靶蛋白分子對接情況Fig.7 Docking of key active compounds and PPI core target protein molecules in “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba”注：圖左側表示“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對活性成分配體結構與PPI核心靶受體蛋白的表觀結合模式圖，可見配體分子被鑲嵌在蛋白中；圖中間為加工后的直徑為5A的蛋白活性口袋對配體分子的包裹情況，彩色飄帶表示修飾后的蛋白主鏈，彩色囊性結構為活性口袋，分子結構為活性物質成分；圖右側為活性分子與核心靶蛋白氨基酸殘基的對接情況，配體與氨基酸殘基之間的黃色虛線為其相互聯系的氫鍵。Note:The picture on the left indicates the apparent binding of the “Lobeliae Chinensis Herba-Hedyotis Herba” drug pair to the active allosome structure to the PPI core target receptor protein,and the ligand molecules are embedded in the proteins;The middle picture indicates the wrapping of the ligand molecules by the processed 5A diameter protein active pocket,the colored ribbon represents the modified protein backbone,the colored cystic structure as the active pocket,and the molecular structure as the active material components;The picture on the right shows the docking of the active molecule with the amino acid residues of the core target,and the dashed yellow dashed line between the ligand and amino acid residues is its interconnected hydrogen bond.

3 討論與結論

銀屑病，中醫病機歸結為營血虧虛，血熱內蘊，化燥生風，肌膚失養。《外科正治全書》云：“白匕，皮膚燥癢，十指間皮厚而莫能瘙癢”。多以涼血活血，養血潤燥，清熱解毒為基本治則。銀屑病是一種多條信號通路失調導致的皮膚炎癥性疾病，T細胞以及表皮細胞介導的慢性炎癥是其主要發病原因[10]。現代研究證明，半邊蓮中的植物多糖具有調節免疫功能的生物活性，其可以劑量依賴的方式增加細胞增殖、吞噬作用，以及調節一氧化氮產生和細胞因子分泌[11,12]，白花蛇舌草水提物可以影響T細胞及B細胞的增殖來影響免疫反應，亦有研究表明其可增強巨噬細胞的吞噬活性，增加NK細胞活性來促進正常小鼠的免疫反應[13]。然而，檢索近年來國內外文獻發現，目前尚無針對“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對銀屑病的有效化學成分、作用靶點、信號通路及生物學途徑等具體機制的研究。故本研究旨在網絡藥理學的基礎上明確“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對銀屑病的作用機制、具體靶點及作用通路。

根據本次研究結果可知：首先，“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對治療銀屑病起關鍵作用的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、刺槐素、β谷甾醇、環三烯酚等，其中槲皮素是半邊蓮、白花蛇舌草共有的有效活性成分，在“活性成分-交集靶標”的網絡拓撲圖中的度值最高，其是許多天然植物中富含的膳食類黃酮，有研究表明，Src家族酪氨酸激酶在銀屑病發病中高度表達，而槲皮素可以明顯抑制在病程中的上調，且可以抑制銀屑病樣小鼠模型中NF-κB、IKKα、NIK的表達以及促進TRAF3的表達而降低了血清中TNF-α、IL-6和IL-17的水平，提高了谷胱甘肽、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性來發揮抑制銀屑病進展的作用[14,15]。木犀草素對角質形成細胞和成纖維細胞以及多種免疫細胞具有抗氧化和抗炎活性，還在延緩皮膚衰老以及炎性皮膚病的治療中發揮重要作用，尤其是對咪喹莫特誘導的BALB/c小鼠銀屑病樣病變中具有緩解作用，其機制不僅與抑制炎性介質IL-17A、IL-6、TNF-α、IL-23相關，及NF-κB信號通路相關，還能調節免疫反應，對于銀屑病小鼠的免疫細胞，木犀草素降低Th1/Th2和Th17/Treg的比例，抑制外周血Th1和Th17的增加，抑制HSP90蛋白的表達和外泌體分泌、調節免疫細胞比例來減輕銀屑病的皮損和癥狀[16-18]。山奈酚干預銀屑病皮損在研究主要集中在免疫細胞的調節上，其可顯著減少銀屑病皮損中CD3+T細胞浸潤和主要促炎細胞因子(包括IL-6，IL-17A和TNF)的表達，且山奈酚還降低了銀屑病小鼠脾臟和淋巴結中IL17A+/CD4+T細胞的百分比[19]。通過本網絡藥理學預測的“半邊蓮-白花蛇舌草”的關鍵活性成分從調節免疫、抑制炎性介質等多途徑發揮干預銀屑病的作用，查閱相關文獻均有基礎研究證實相關預測，說明本預測準確性較高。

篩選出AKT1、JUN、MAPK1、RELA、HSP90AA1、IL6、ESR1、MAPK8、EGFR、MAPK14等10個核心靶蛋白，可能在“半邊蓮-白花蛇舌草”藥治療銀屑病的過程中起重要作用。AKT1為PI3K通路的下游關鍵結構，AKT1在銀屑病皮損的表皮層高度活化，其磷酸化激活一系列功能不同的蛋白質復合物，包括mTOR，mTOR激酶的上調已在銀屑病患者皮損中得到證實[20]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一種絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶，在許多的炎癥性疾病和自身免疫疾病中都發揮著重要的作用，其中c-Jun氨基末端激酶是其重要的一條亞通路，c-Jun的活化可以并激發炎性因子IL-6的產生，從而加劇銀屑病皮損處的炎癥反應[21]。RELA轉錄因子在角質形成細胞的增殖和分化細胞的應激反應過程中起著核心作用，RELA的磷酸化促進p65的表達而增強NF-κB的激活，從而加強淋巴細胞、內皮細胞、樹突細胞和角質形成細胞的過度增殖[22]。在分子模擬對接的結果中，半數的篩選活性靶蛋白與“半邊蓮-白花蛇舌草”的關鍵活性成分具有較優的活性對接，說明反向驗證支持預測結果，本研究具有一定意義的參考價值，其中HSP90AA1受體蛋白表現出的平均對接活性最佳，HSP90AA1是休克蛋白家族中的重要一員，與細胞凋亡、分裂以及新生血管生成密切相關[23]，但目前與銀屑病的發病相關的基礎研究尚缺乏充分的文獻支持，有研究表明[24]，熱休克蛋白會影響先天性和適應性免疫反應，并且其抗體對調節性T細胞的直接刺激作用及其對角質形成細胞的抗增殖作用，使得其有希望成為銀屑病等相關自身免疫性皮膚病的潛在治療靶點。

本研究中KEGG通路富集分析中，“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對干預銀屑病的共同靶點的基因功能主要富集在主要涉及缺氧誘導因子通路、PI3K-Akt、腫瘤壞死因子(TNF)通路、IL-17、Th17細胞分化、VEGF相關信號通路、Th1和Th2細胞分化等信號通路，與血管生成、炎性反應、免疫介導密切關系的信號通路上。缺氧誘導因子(HIF-1α)的增加參與銀屑病的發病，上皮角質形成細胞中的增加可能有助于促進血管生成和皮膚炎癥[25]。PI3K/Akt構成了包括皮膚在內的重要細胞內信號通路，在銀屑病的發展中起著關鍵作用，并且PI3K/Akt途徑在誘導角質形成細胞(HIF-1α)表達中的發揮關鍵作用[26]。從免疫調節的相關預測通路來看，銀屑病是一種與Th17細胞和IL-17A介導的炎癥相關的慢性皮膚疾病，Th1和Th17的活化促進了角質形成細胞的增殖，遷移和侵襲從而加速疾病的進展，且多數單抗生物制劑針對其而發揮作用，從而阻斷下游IL-17、TNF-α等炎性介質而延緩發病[27]。血管內皮生長因子在多種炎癥性免疫介導的疾病的發病機理中起著至關重要的作用，近年來有學者提出抗血管生成療法[28]，并研究發現，某些銀屑病療法可降低皮損斑塊的乳頭狀真皮中循環的VEGF-A水平并使相關的血管病理正常化[29]，VEGF-A及其通過其受體的信號傳導可能是潛在的銀屑病干預途徑。銀屑病是一種病因尚未清楚的慢性炎癥性皮膚病，表皮增殖過度以及新血管生成是目前被廣泛認可的發病機制，與本研究的預測之信號通路存在多數重疊性。

綜上所述，本研究基于網絡藥理學及分子模擬對接的方法以“半邊蓮-白花蛇舌草”藥對為研究對象，基于口服生物利用度篩選活性成分及作用靶點，綜合分析其干預銀屑病的生物學途徑及通路，并用反向分子對接進行驗證，得出活性成分干預銀屑病涉及多通路及途徑，多數結果查閱文獻有相關循證基礎研究的支持，部分靶點目前證據尚不充分，其具有潛在性，可進一步實驗驗證。然而局限性亦存在，本研究基于藥物數據庫篩選藥物活性成分，預測的準確性對數據庫的完整性有所依賴，其次，本研究結果僅是一種理論上的作用機制的探討，仍需通過進一步實驗來驗證藥物作用的具體機制。