人源腸道菌中轉化連翹苷制備連翹脂素的菌株篩選及固定化

郭雪健，李彬春，趙 邑，尉敬濤，張立偉

1山西大學分子科學研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室；2山西省生物研究院；3山西大學生物技術研究所，太原 030006

連翹脂素，主要存在于中藥連翹、桂花、小白菊及石榴籽中。近年來，人們發現連翹脂素具有多種藥理活性，如抗炎活性[1]、抑制人肺癌細胞株增殖[2]、抑制胰腺癌細胞的增殖和遷移[3]、調節自發性高血壓大鼠收縮壓和舒張壓[4]等。連翹脂素是連翹苷脫糖后的苷元(見圖1)，Quan[5]、Mao等[6]研究發現連翹脂素在抗炎及抗癌效果上優于連翹苷，此外，Ye等[7]發現連翹脂素的生物利用度較連翹苷高。目前，連翹脂素的制備方法主要有兩種：直接從植物中提取和經由連翹苷轉化獲得。Wang等采用發酵連翹葉的方式制備獲得連翹脂素[8]。Mei等[9]從土壤中篩選得到一株具有轉化連翹苷生成連翹脂素的霉菌，還有使用纖維素酶或酸水解連翹苷制備連翹脂素[10]。但以上方法都存在一些缺陷，如酶的加入易造成乳化現象使產物難以分離制備；酸和霉菌可造成連翹脂素不穩定產生副產物。基于以上原因，目前還沒有一種簡單易行、完整可靠的轉化方法，需進一步完善。

圖1 連翹苷及連翹脂素結構式Fig.1 Molecular structures of phillyrin and phillygenin

有報道稱連翹苷與人的腸道菌共孵育后會代謝產生連翹脂素。并且，連翹脂素可進一步代謝為小分子物質[11]。因此，本研究希望從人源腸道菌中篩選出可以高效轉化連翹苷制備連翹脂素的菌，以彌補現有方法的不足，旨在為連翹脂素的進一步開發利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

GAM液體培養基、GAM固體培養基、革蘭氏染色試劑盒(北京Solarbio生物科技有限公司)；連翹苷(批號：MUST-18020210)、連翹脂素(批號：MUST-18072402)(成都曼思特生物科技有限公司)；色譜甲醇(Fisher Scientific 上海公司)。

ACQUITY H-class UPLC(美國 Waters 公司)；ionexUltiMate 3000超高效液相色譜及四級桿-靜電場軌道阱高分辨質譜聯用儀、Xcalibur工作站(美國Thermo Fisher Scientific公司)；LAI-3T 厭氧培養箱(上海龍躍儀器設備有限公司)；高壓蒸汽滅菌鍋(上海三申醫療器械有限公司)。

1.2 菌株篩選

1.2.1 腸道菌混懸液與培養基的制備

取健康成人的4 g中段糞便，立即溶于20 mL冰浴生理鹽水中，攪拌均勻后經三層紗布過濾取上清，即為腸道菌混菌液[12]。

配置GAM液體培養基，滅菌后加入連翹苷至終濃度為0.5 mg/mL。藥物空白的GAM培養基為同法配置，但不含連翹苷。

1.2.2 菌株初篩

菌株初篩的主要目的是確定混菌液中含有轉化連翹苷的菌株，并利用連翹苷的抗菌作用縮小菌株篩選范圍[13]。具體方法為：量取4 mL含底物的GAM液體培養基于5 mL離心管中，加入腸道菌混懸液1 mL，置于37 ℃厭氧培養箱中培養12 h后取出。吸取1 mL轉化液加入4 mL甲醇，離心去除蛋白，將上清液減壓蒸干后，用2 mL乙酸乙酯溶解提取三次，過濾，合并溶解液減壓蒸干，然后用1 mL甲醇復溶，過0.22 μm濾膜、UPLC分析。同時做菌液空白及底物空白，各樣平行3份。

1.2.3 菌株復篩及純化

取“1.2.2”中轉化液，配制濃度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌液。取100 μL涂布平板，于37 ℃下厭氧培養后挑取平板中形態及顏色不同的單菌落，于試管中劃線培養再純化，至同一試管中長出的菌落形態及顏色均相同，獲得純化的單克隆菌株。取9 mL GAM液體培養基于10 mL帶蓋EP管中，將單菌株擴增培養至OD600值為0.7～0.8。

1.2.4 轉化模型的建立

主要采用Guo等[14]建立的人腸內菌體外轉化模型，并略有修改。取4 mL含底物的GAM液體培養基于5 mL帶蓋EP管中，加入1 mL擴增的菌液，平行制備11份培養。分別于0、1、3、5、7、9、11、13、15、25、35 h取出一管。吸取1 mL加入2 mL甲醇中淬滅，并離心去除蛋白后按“1.2.2”中方法溶解轉化產物分析。單菌株保存于終濃度為20%甘油中，置于-80 ℃冰箱保存。

UPLC色譜分析條件：使用Waters ACQUITY H-class型超高效液相色譜儀(UPLC)，ACQUITY-UPLC-BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1×100 mm)。流動相為乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫(0～4 min：10%→23%A；4～9.5 min：23%→23%A；9.5～11 min：23%→30%A；11～15 min：30%→40%A；15～17 min：40%→10%A；17～18 min：10%A)。流速0.3 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫40 ℃，進樣量2 μL。

標準曲線的繪制：以甲醇為溶劑配制濃度分別為0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的連翹苷對照品溶液，進行UPLC分析，繪制標準曲線。同法繪制連翹脂素對照品溶液標準曲線。

1.2.5 轉化模型的方法學驗證

1.2.5.1 精密度考察

日內精密度為在同一天內將連翹苷和連翹脂素對照品溶液各濃度的樣品連續測定6次。根據標準曲線計算濃度和連續6次進樣的相對標準偏差(RSD)和準確度(RE)[14]。日間精密度為將各濃度的同一樣品連續進樣3天，每天進樣2次。

1.2.5.2 基質效應和回收率試驗

按“1.2.2”中方法除去GAM培養基中的蛋白，再用其分別配制不同濃度的連翹苷和連翹脂素溶液，每個濃度平行6份，得到樣品A。然后，用甲醇代替除去蛋白的GAM培養基，同法配制，得到樣品B[14]。另用GAM培養基配制連翹苷和連翹脂素溶液，除去蛋白得到同樣濃度的樣品C。分別分析A、B和C，計算連翹苷和連翹脂素的濃度[14]，按照A/B×100%和C/A×100%計算基質效應和回收率。

1.2.5.3 重復性考察

用GAM培養基配制3個不同濃度的連翹苷和連翹脂素溶液，每個濃度6份，除去蛋白得供試品溶液[14]。

1.2.6 液質聯用對產物鑒定

采用超高效液相色譜-質譜聯用(UPLC-MS)的方法，將連翹苷的轉化產物與標準品比對保留時間、一級碎片和二級碎片來鑒定產物。

質譜參數為：離子源以電噴霧離子源(ESI)離子化方式；掃描模式：full scan/dd-MS2，正負離子切換并同時采集模式；正離子模式噴霧電壓為3.5 kV，負離子為2.5 kV；質核比采集范圍100～1000；毛細管溫度320 ℃；鞘氣體積流量35 arb，輔助氣體積流量10 arb；加熱器溫度300 ℃；碰撞量設定為12.5、25和37.5 eV；分辨率設定為MS full scan 35000 FWHM以及MS/MS 17500 FWHM[15]。

1.2.7 菌株鑒定

觀察包括液體培養與平板培養后的菌株，并用革蘭氏染色法染色后進行顯微觀察。

16S rDNA測序分析：本部分16S rDNA測序工作交由華大基因科技有限公司武漢分公司完成。利用Premier 5.0軟件設計細菌的擴增引物得27f：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT。然后提取目的基因后擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，上機測序。將所得序列提交NCBI網站在線Blast分析序列的同源性，并與數據庫中的序列進行比對分析，利用MEGA 5.1軟件構建16S rDNA序列系統發育樹。

1.2.8 菌株轉化的氧氣條件考察

大腸桿菌SXUXJ-1為革蘭氏陰性兼性厭氧菌，為了提高后續實驗操作的簡便性，需要對其轉化條件的需氧性進行探究。在“1.2.4”的基礎上只改變厭氧培養為普通培養箱中培養，其余條件均不改變，同時做厭氧培養對照。

1.3 菌株的固定化

1.3.1 固定化菌球的制備

取9 mL不同濃度的海藻酸鈉溶液，加入菌液1 mL(平板菌落計數法[16]測得活菌數為3×1011～4×1011CFU/mL)，攪拌均勻后使用1 mL的注射器吸取溶液，在距離氯化鈣溶液液面垂直距離為10～15 cm處，將海藻酸鈉溶液勻速滴入氯化鈣溶液中，邊滴入邊勻速搖動。靜置交聯后濾出菌球，用滅菌的生理鹽水沖洗菌球3遍后備用。然后進行單因素條件探究，分別考察海藻酸鈉濃度、氯化鈣溶液濃度、交聯時間對菌球比活力的影響。最后，通過正交實驗優化制備條件。

1.3.2 固定化菌球的酶活檢測

對硝基苯酚(p-nitrophenol，pNP)標準曲線繪制：配制濃度分別為30.3、60.6、121.2、151.5、242.4、303、484.8、606 μmol/L的pNP溶液。吸取100 μL的pNP溶液加入100 μL的Na2CO3溶液混合均勻，然后取100 μL于96孔板中，用酶標儀在400 nm處測吸光度，以pNP濃度(μmol/L)為橫坐標，以OD400為縱坐標繪制標準曲線。

固定化菌球酶比活力的檢測參照文獻[17]稍作修改：取5 g菌球放入5 mmol/L的pNPG(對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷)溶液中，于37 ℃下誘導產酶1 h后濾出固定化的菌球，沖洗3遍。然后將菌球放入10 mL濃度為5 mmol/L的pNPG溶液中，置于37 ℃的搖床中以150 rpm反應1 h。取初加入菌球時(空白)和反應結束時的pNPG溶液各100 μL分別測吸光度，每組3平行。β-葡萄糖苷酶酶比活力計算公式如下：

公式中，比活力的單位為U/g；ΔC：pNP摩爾濃度差(mmol/L)；V：pNPG溶液體積(mL)；t：反應時間(h)；m：菌球質量(g)。

固定化菌球酶活大小以β-葡萄糖苷酶酶活力大小評價，一個酶活單位(U)定義為：在上述反應條件下，每小時釋放1 μmol的pNP所需要的固定化菌球量。

1.3.3 固定化菌球轉化連翹苷研究

配置10 mL的連翹苷生理鹽水溶液，調整pH值后超聲15 min。取5 g菌球放入溶液中，在不同溫度的恒溫振蕩箱中以150 rpm轉化20 h后取出。向體系中加入30 mL甲醇終止反應，并超聲提取15 min。按“1.2.2”中方法溶解產物并計算連翹苷的轉化率，平行重復3次。分別考察pH值、溫度和底物濃度的對轉化率的影響。

菌球的耐用性考察：根據單因素確定的最優轉化條件將同一批菌球連續使用14天，每天使用一次，觀察連翹苷轉化率的變化。

2 結果與討論

2.1 連翹苷、連翹脂素標準曲線

連翹苷標準曲線符合線性回歸方程y=4 156 129x+36 654，相關系數R2為0.999 2，線性范圍為0.01～1 mg/mL；連翹脂素標準曲線符合線性回歸方程y=6 163 326x+83 565，相關系數R2=0.999 0，線性范圍為0.01～1 mg/mL。式中y為峰面積，x為標準品濃度(mg/mL)。

2.2 方法學驗證結果

如表1所示，連翹苷和連翹脂素的RSD和RE均符合要求，該方法的日內、日間精密度和準確度良好。如表2所示，連翹苷和連翹脂素的基質效應和回收率的誤差都在±5%以內，并且重復性的RSD在2%以內，表明模型可靠可以用于后續轉化研究。

表1 精密度、準確度考察結果(n=6)

表2 基質效應、回收率和重復性考察結果

2.3 菌株篩選結果

篩選純化后獲得了一株具有較強的連翹苷轉化能力的單菌株，命名為SXUXJ-1。圖2為該菌株的平板生長圖。

圖2 菌株SXUXJ-1在平板上生長圖Fig.2 The growth of strain SXUXJ-1 on the plate

圖3反應了菌體在培養開始后5 h進入對數生長期，同時開始轉化連翹苷；15 h后進入穩定期，此時連翹苷已基本轉化完全。反應持續20 h后，產物連翹脂素的量基本保持不變。

圖3 菌株(SXUXJ-1)生長曲線及轉化連翹苷的時效曲線Fig.3 The growth curve and the time-activity curve of transforming phillyrin of strain (SXUXJ-1)

從圖4中可以看出，連翹苷轉化產物的液相保留時間與連翹脂素對照品一致。

2.4 產物UPLC-MS分析結果

在正離子模式下，比較產物與標品相對豐度最高(依次為355.15、373.16、390.19、189.09、395.15)的五個分子離子峰保持一致。推測其中質核比為355.15的碎片為連翹脂素中性損失水而產生。比較其二級質譜圖，相對豐度最高的五個碎片分別為337.14、355.15、284.10、137.06、286.11。以上五個碎片在產物與標準品中均保持一致。

結合圖4中樣品與標準品液相色譜保留時間的一致性，及連翹脂素的理論生成量與實際生成量無明顯差別，可以判斷產物為連翹脂素。并且在轉化體系中，連翹脂素生成后可以在20 h內保持穩定，無副產物生成。

圖4 菌株SXUXJ-1轉化連翹苷液相色譜圖Fig.4 Liquid chromatographic image of phillyrin transformed by strain SXUXJ-1注：A為菌液空白組；B為實驗組12 h；C實驗組轉化結束；D為混標。Note:A:Bacterial liquid blank group;B:Experimental group 12 h;C:The end of transformation of experimental group;D:Mixed stand-ard solution.

2.5 菌株的鑒定結果

如圖5所示，經革蘭氏染色后在顯微鏡下可觀察到菌株SXUXJ-1呈短桿狀，兩端圓頭。圖2所示平板上菌落為圓或近圓，邊緣整齊表面光滑，顏色為乳白色，培養24 h后菌落大小為2 mm，在有氧或無氧狀態均可生長。菌株在液體培養基中培養24 h后培養基變渾濁，產生氣泡及沉淀。革蘭氏染色結果為陰性。

圖5 菌體顯微形態Fig.5 Micromorphology of the strain

16S rDNA測序結果經拼接，得到菌株SXUXJ-1的16S rDNA序列，長度為1 409 bp，序列如下：

將測序所得序列與NCBI Genbank數據庫進行blast同源序列分析。通過繪制菌株系統進化樹(圖6)發現，菌株SXUXJ-1與埃希氏屬大腸桿菌(Escherichiacoli)的多個菌株具有較高的同源性，與登錄號為CCFM8336及KVP104的大腸桿菌菌株具有99.86%的相似度，序列比對覆蓋率達100%。參考《伯杰氏細菌手冊》第八版相關內容及測序結果，綜合該菌株的形態特征及革蘭氏染色結果，可以確定菌株SXUXJ-1為腸桿菌科埃希氏屬大腸桿菌，已保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號：CGMCC No:21514。

圖6 菌株SXUXJ-1 16S rDNA序列系統發育樹Fig.6 Phylogenetic tree of SXUXJ-1 based on 16S rDNA

2.6 有氧與厭氧培養對比

有氧及厭氧培養條件下連翹脂素的最終得率分別為96.9%和96.0%。結合表3，可以看出是否提供厭氧培養條件對連翹苷轉化率與連翹脂素轉化得率無明顯影響。在后續轉化中無需提供嚴格厭氧條件，這樣可以減少成本及降低操作復雜性。

表3 有氧及厭氧培養對比

2.7 菌株的固定化條件

對硝基苯酚標準曲線符合線性回歸方程y=0.002 075x+0.050 51，相關系數R2=0.998 7，線性范圍0～606 μmol/L，式中y為吸光度，x為對硝基苯酚濃度。

圖7 單因素考察結果Fig.7 Results of single factor investigation

根據圖7單因素結果確定的最佳條件為海藻酸鈉濃度2.5%、CaCl2濃度3.5%、交聯時間3 h。則正交實驗因素水平設置為：A海藻酸鈉濃度2、2.5、3%；B氯化鈣濃度3、3.5、4%；C交聯時間1、3、5 h。

通過極差分析可知(見表4)，3個因素對酶活影響的大小順序為：A>C>B，即海藻酸鈉濃度>交聯時間>氯化鈣濃度。

表4 正交實驗結果

正交分析的效應曲線給出固定化菌球工藝條件為海藻酸鈉濃度為3%，氯化鈣濃度為3.5%，交聯時間3 h，以此工藝條件制作的凝膠球如圖8所示，膠球大小適中，機械強度較好。

圖8 海藻酸鈉凝膠球Fig.8 Sodium alginate hydrogel beads

根據最優條件重復三次驗證得到酶活平均為0.836 U，標準差(SD)為0.013 3，相對標準偏差(RSD)為1.6%。

在pH值條件考察中，pH值為8時連翹苷的轉化率達到最大82.5%，說明此時菌體活力旺盛，轉化效率最高，因此確定pH值8為最適條件。

當底物濃度逐漸增大時，由于連翹苷具有一定的抗菌作用，濃度過大必然會在一定程度上影響微生物生存，同時也會超過菌的催化能力，則轉化效率較低，經濟性不高；而如果底物濃度過小時，又不利于充分發揮菌球效力。因此，菌球與底物濃度之間存在一個最佳比例。從圖9中可以看出，當底物濃度從0.2～0.8 mg/mL逐步增大時，連翹苷的轉化率下降緩慢。這可能是由于菌球提供的酶量較為充足，底物可以與酶充分接觸。而當底物濃度高于0.8 mg/mL后，連翹苷的轉化率急劇下降，這可能是因為底物量超過了體系中酶的最大催化能力，而使連翹苷的轉化率下降。因此綜合考慮轉化率以及經濟性，選擇底物濃度為0.8 mg/mL。

圖9 單因素條件轉化條件考察Fig.9 Investigation on single-factor condition transformation process

2.8 轉化條件考察結果

腸桿菌科的細菌一般最適溫度在33～42 ℃，因此本研究選擇考察范圍為30～45 ℃。如圖9所示，當溫度為39 ℃時，連翹苷轉化率最大，即選擇39 ℃為最優轉化溫度。

綜上，確定固定化菌球轉化連翹苷的條件為pH值為8，底物濃度為0.8 mg/mL，溫度為39 ℃。在此條件下重復三次，得到連翹苷在20 h內的轉化率分別為84.3%、85.7%、85.6%，平均轉化率達到85.2%，將轉化時間延長至25 h左右，連翹苷即可實現完全轉化；計算連翹脂素的最終得率分別為96.8%、97.2%、96.9%，平均得率為97.0%。

2.9 菌球的耐用性

圖10所示固定化菌球連續循環使用13次后，連翹苷在20 h內的轉化率仍能達到70.2%。說明在此工藝條件下，微生物經固定化后可以維持其生命活力，連續產生酶，菌球具有良好的耐用性。

圖10 菌球的耐用性Fig.10 Durability of the bacteria ball

3 討論與結論

首先在篩菌研究中，由于連翹苷具有一定的抗菌作用，我們在初篩所用的液體培養基及復篩所用的平板培養基中均加入一定量的連翹苷，可以抑制與連翹苷不友好的菌株生長，為篩選縮小了一定的范圍。其次，已有研究表明，連翹苷在腸道菌的作用下轉化為連翹脂素后會繼續代謝產生副產物[11]。本研究篩選得到的單菌株在轉化連翹苷得到連翹脂素后，產物可在20 h內保持穩定，未發生繼續代謝，無副產物的生成。本方法克服了已有微生物轉化法中連翹脂素繼續被代謝的缺點，也未引入多余基團。再次，大腸桿菌是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，由于其良好的生長活力及可有效利用廉價碳源，在基因工程中被改造為工程菌。其兼性厭氧的特點對于發酵工程上具有重要的意義，本研究篩選到的大腸桿菌同時具備以上特性。最后，我們還使用固定化微生物的方法將菌株SXUXJ-1固定，通過優化制作工藝最終制得了一種實用性較強的菌球。在最優轉化條件下，連翹苷可在25 h左右轉化完全。固定化菌球轉化法是一種簡單、高效、環保的方法，且轉化后的產物連翹脂素易于提取分離，因此具備非常好的應用前景。