南海杯葉海綿Phyllospongia sp.的甾體化學成分研究

康永鋒，段 松，張紅軍，甘建紅,*

1上海海洋大學食品學院，上海 201306；2中國人民解放軍第二軍醫大學長征醫院藥學部，上海 200433；3上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心；4食品科學與工程國家級實驗教學示范中心，上海 201306

海綿屬多孔動物門(Porifera)，是最原始的低等多細胞動物，海綿多變的生境和原始的進化地位，使其產生并積累了大量結構新穎且具有抗腫瘤、抗寄生蟲、抗病毒、抗菌、抗炎和免疫調節等不同生物活性的次生代謝產物，是海洋天然產物的首要來源[2,3]。我國南海海域遼闊，是世界上海綿集中分布的海域之一，多年來南海海綿一直是被研究的海洋天然產物化學研究熱點生物之一[4]。早在1933年，美國耶魯大學的Bergmann教授開始對海綿的化學成分進行研究，從中得到了甾體類成分。1951年，他從海綿Phyllospongiasp.中分離獲得了spongothymidine和spongouridine 等核苷類化合物；后來的抗病毒藥阿糖腺苷和抗癌藥阿糖胞苷就是spongothymidine的合成類似物[5,6]。從海綿研究中獲得的laulimalide、peloruside A、salicylihalimide A、variolins、dictyodendrins已作為抗腫瘤藥進入臨床前研究[7]。

本文的研究對象杯葉海綿Phyllospongiasp.屬尋常海綿綱(Demospongiae)，網角海綿目(Dictyoceratida)，角骨海綿科(Spongiidae)海綿[8]。目前，國內外有很多課題組對該種海綿進行了系列研究報道，從中分離得到許多結構新穎的次生代謝產物，包括二倍半萜類、甾體類、二苯基醚類、甘油糖脂類和神經酰胺類等化合物[9]。其中含有獨特的四環或五環scalarane型的二倍半萜類和甾體類化合物占大多數。但其生物活性研究報道較少，為了更好地闡明Phyllospongiasp.中具有生物活性的成分，本實驗綜合運用各種現代色譜和光譜技術，對提取物的石油醚和乙酸乙酯部位分離的化合物進行研究，并進行細胞毒活性的篩選，豐富了Phyllospongiasp.的成分，為后續該海綿的活性成分的開發與利用奠定了基礎。

1 材料與方法

Q-Tof micro YA019型液質聯用儀、Bruker AV-600型核磁共振儀、Waters 1525/2996高效液相色譜儀(美國Waters公司)；EYELAN-2000型旋轉蒸發儀；Sephadex LH-20凝膠柱(美國Pharmacia公司)；層析硅膠(200～300目)、TLC高效薄層層析板(煙臺江友硅膠開發有限公司)；甲醇、乙腈、正已烷(色譜純，美國Promptar公司)；二氯甲烷、甲烷、石油醚、乙酸乙酯、丙酮(分析純，上海化學試劑公司)；氘代試劑(上海思域化工科技有限公司)；顯色劑用10%硫酸香蘭素溶液。

MCF-7(人乳腺癌細胞株)、HT-29(人結腸癌細胞細胞株)、Hep-2(人喉癌上皮細胞株)(上海交通大學細胞中心)；HF 90 CO2培養箱(上海力升科學儀器)；Nikon Eclipse倒置顯微鏡，LDZM位式壓力蒸汽滅菌鍋(上海申安醫療器械廠)；Spark多功能酶標儀試劑(瑞士Tecan公司)；離心機(上海貝克曼庫爾特儀器設備)；胎牛血清、DMEM高糖培養基(美國Hyclone 公司)；青鏈霉素混合液、PBS、MTT、胰酶(上海鼎國生物技術有限公司)。

杯葉海綿Phyllospongiasp.(XS-2019.12)樣品于2019年12月采自中國南海西沙永興島附近，種屬名稱經上海交通大學林厚文教授和本文作者之一張紅軍教授鑒定為Phyllospongia屬海綿(Phyllospongiafoliascens)。標本(XS-2019.12)存放于上海海洋大學食品學院。

1.1 提取與分離

將冷凍的杯葉海綿(Phyllospongiasp.，干重2.0 kg)切碎后，用丙酮超聲1 h提取共3次；每次用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)混合溶劑超聲1.5 h提取，共3次。合并提取液，減壓濃縮得到總浸膏32.0 g，將其混懸分散于90 %的甲醇溶液中，用石油醚萃取3次，濃縮萃取液得到石油醚部位浸膏(12.5 g)；再加水將混懸液的甲醇濃度調整至65 %，用二氯甲烷萃取3次，濃縮萃取液得到二氯甲烷部位浸膏(6.3 g)。將石油醚部位浸膏進行減壓硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(100∶1→5∶1)梯度洗脫，根據 TLC顯色合并相似流分得到 7個組分Fr.a ～ Fr.g。對組分Fr.e進行正相硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(100∶1→5∶1)梯度洗脫，根據TLC顯色合并相似流分得到5個組分(Fr.e1 ～ Fr.e5)。其中Fr.e-3(13.7 mg)以95%甲醇-水(含0.1%甲酸，2 mL/min，UV 254 nm )經高效液相色譜洗脫，得到化合物1(1.5 mg，tR= 35 min)、2(2.5 mg，tR= 38 min)和3(1.9 mg，tR= 47 min)。Fr.e-4(18.5 mg)以90%甲醇-水(含0.1%甲酸，2 mL/min，UV 254 nm )經高效液相色譜洗脫，得到化合物4(2.4 mg，tR= 32 min)和5(2.7 mg，tR= 39 min)。將二氯甲烷部位浸膏按照上述同樣的方法，經HPLC檢測合并得到5個組分(Fr.1 ～ Fr.5)，其中Fr.3(20.4 mg)以75%甲醇-水(2 mL/min，UV 254 nm)經制備液相色譜洗脫，得到化合物6(2.3 mg，tR= 19 min)、7(1.3 mg，tR= 26 min)和8(2.5 mg，tR= 34 min)。

1.2 細胞毒活性篩選

將MCF-7、HT-29和Hep-2細胞株用含10%新生胎牛血清的DMEM完全培養基培養，37 ℃，5% CO2培養箱培養至細胞覆蓋率達85%以上時傳代，生長狀態良好的細胞用于實驗研究[10]。用MTT法檢測化合物對MCF-7、HT-29和Hep-2細胞的抑制作用，將三種細胞進行細胞計數后接種于96孔板內(體積為100 μL/孔)，設相應濃度的溶媒對照孔，然后加入不同濃度的受試藥物100 μL/孔，每個濃度設3個復孔，空白組加入等量含0.1% DMSO的培養基[11]。以順鉑為陽性對照，在培養箱中培養48 h后用MTT法檢測細胞生長情況。取出細胞培養板，倒置顯微鏡下觀察細胞形態。每孔加入10 μL MTT，置培養箱中繼續培養4 h。棄去MTT，然后在DMSO中溶解[12]。用酶標儀在測定550 nm處的OD值，計算IC50，試驗反復進行3次。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

從杯葉海綿Phyllospongiasp.的石油醚和二氯甲烷萃取部位首次分離鑒定了8個甾體類化合物(1～8)(見圖1)。

圖1 化合物1～8的結構式Fig.1 Chemical structures of compounds 1-8

2.2 細胞毒活性實驗結果

檢測化合物對MCF-7、HCT-116和Hep-2的細胞毒活性，鏡下觀察可見，化合物3、6和8組細胞生長形態規則，破碎不明顯，其余各化合物不同劑量組細胞形態不規則出現細胞破碎等現象，陽性對照順鉑組細胞出現明顯的細胞破碎現象。各化合物對以上三種細胞的IC50值如表1所示。化合物7對MCF-7具有顯著的細胞毒活性，IC50值為3.9 μmol/L，順鉑為陽性對照(IC50= 6.0 μmol/L)；化合物2對Hep-2有較好的細胞毒活性，IC50值為10.6 μmol/L，順鉑為陽性對照(IC50= 6.3 μmol/L)。

表1 各化合物對MCF-7、HT-29和Hep-2的IC50值

3 結論

本文對采自我國南海西沙群島的杯葉海綿Phyllospongiasp.進行了化學成分研究，首次從石油醚和二氯甲烷部位中分離得到8個甾體類化合物，并采用MTT法測試了其對MCF-7(人乳腺癌細胞)、HT-29(人結腸癌細胞)和Hep-2(人喉癌上皮細胞)的細胞毒活性試驗，其中化合物1、3、4、6、8對人結腸癌細胞HT-29毒活性較弱，IC50均大于83 μmol/L；化合物1、2、7對MCF-7的細胞毒活性顯著，IC50分別為8.8、10.3、3.9 μmol/L；化合物2對Hep-2的細胞毒活性較好，IC50為10.6 μmol/L。實驗結果表明化合物7的細胞毒活性優于陽性對照藥順鉑組，由于該化合物的含量較少，且未有文獻報道顯著活性，故有望通過結構修飾或有機合成發展成為新的抗腫瘤藥物的潛力。這些工作進一步對南海西沙海綿資源和生物活性的考察和研究，尋求高效低毒的新的抗腫瘤化學結構和先導化合物提供了參考依據。