UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術快速鑒定木芙蓉花化學成分

王 藝，馮麗萍，黃李璐，胡 攀，嚴 鑫，王 希，鄭 雨，夏厚林*

1成都中醫藥大學藥學院，成都 611137；2成都市中草藥研究所，成都 610016；3成都市植物園，成都 610083

木芙蓉花，為錦葵科木槿屬植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥花，《本草綱目》云：“此花艷如荷花，故有芙蓉、木蓮之名……”[1]，又有華木、拒霜、霜降花等多個稱謂。味微辛、性涼，歸肺、肝經，有清肺涼血，散熱解毒，消腫排膿之效，臨床上多用于治療肺熱咳嗽、瘰疬、腸癰、白帶等，外用還可用于治療癰癤膿腫、膿耳、無名腫毒、燒燙傷等，收載于2019版《廣東省中藥材標準第三冊》[2]。

四川成都自古以來盛栽芙蓉，芙蓉花從1983年開始被定為成都市“市花”，是天府文化的重要組成元素，它不僅是城市地域人文特征的濃縮和象征，更是城市形象的重要標志和特色名片。除了人文方面的深厚積淀，木芙蓉也是兼具營養價值和藥用價值的藥食同源性中藥，現代藥理研究表明其具有抗過敏[3]、降低血糖[4]等作用并對溶血性鏈球菌有較強抑制作用[2]，其提取物也被廣泛應用于化妝品[5]和食品的原料或添加品[6]等方面。但由于目前國內外關于木芙蓉花化學成分的報道相對較少、相關藥理研究多以粗提物為研究對象、藥效物質基礎的發現與作用機制的闡述不夠深入等因素，其臨床應用相對較少，范圍局限，僅在治療癰腫[7]和炎癥[8]等方面有相關報道，不僅影響木芙蓉花在醫藥基礎研究與臨床應用上的發現與拓展，也是其在食品、化妝品等應用領域發展的瓶頸，故明確木芙蓉花的物質基礎并開展相關的藥效學研究對其應用和開發有著重要意義。超高效液相色譜串聯四極桿靜電場軌道阱質譜技術是近幾年發展起來的新型液質聯用技術，具有分辨率高、質量精度好、定性和定量能力強等特點，在中藥分析領域也展現出了極大的應用前景。因此為了進一步了解木芙蓉花的化學成分，本實驗采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS對其進行化學分析，以期對木芙蓉花的物質基礎做出闡述。

1 材料

Vanquish 型超高效液相色譜聯用Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；KQ-600DE型超聲波清洗器(頻率40 kHz，功率600 W，昆山市超聲儀器有限公司)，Discovery DV215CD型十萬分之一電子天平(美國Ohaus Corporation公司)；BS124S型萬分之一析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

對照品鹽酸黃連堿(中國食品藥品檢定研究院，批號112026-201601)；L-苯丙氨酸、蘆丁、金絲桃苷、椴樹苷(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號分別為CHB180328、CHB190110、CHB171010、CHB180214)；水楊酸、槲皮素、山奈酚(成都埃法生物科技有限公司，批號分別為AF9070721、AF20032451、AF20050953)；異槲皮苷、原兒茶酸(四川省維克奇生物科技有限公司，批號分別為wkq20060104、wkq16012105)；甜菜堿(成都得思特生物技術有限公司，批號DSTDT001202)；腺苷(英國PureChemLand公司，批號PCL-#-Ad559)，以上對照品純度均>98%。色譜乙腈(美國Fisher公司)，色譜甲醇(美國TIDIA公司)，水為超純水，乙醇為分析純。

木芙蓉花樣品于2019年10月中旬采集于四川省成都市三合鎮木芙蓉花種植基地，自然陰干。經成都中醫藥大學藥學院龍飛副教授鑒定為木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥花。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動相：流動相0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脫(0～4 min，95%→90%A；4～10 min，90%→55%A；10～18 min，55%→5%A；18～20 min，5%A)；流速：0.3 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量：3 μL。

2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)，掃描方式：正負離子同時掃描，噴霧電壓：3.5 kV；鞘氣流速：35 psi；輔助氣流速：10 psi；毛細管溫度：320 ℃，探頭加溫器溫度：350 ℃；最大噴霧電流：100 A；S-Lens分辨率：50。掃描模式為全掃描/數據依賴二級掃描(Full MS/dd-MS2)，一級分辨率70 000，二級分辨率17 500，掃描范圍m/z100～1 500。

2.3 對照品溶液的制備

分別稱取甜菜堿、腺苷、苯丙氨酸、原兒茶酸、金絲桃苷、異槲皮苷、水楊酸、蘆丁、椴樹苷、槲皮素、小檗堿、山奈酚適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，制得濃度分別為25 μg/mL混合對照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備

稱取芙蓉花粉末5.0 g，加入90%乙醇25 mL進行回流提取兩次，每次2 h，過濾，合并濾液，過0.22 μm微孔濾膜即得。

3 結果與分析

按“2.1”“2.2”項下條件對木芙蓉花供試品溶液進行UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析，分別得到正負離子模式下的總離子流圖(見圖1、2)。根據得到的高分辨精確化合物分子量，通過Thermo Xcalibur軟件篩選出實測相對分子量與理論相對分子量差值小于5 ppm的化合物，并計算其可能的元素組成。結合mz Cloud、mz Vault、ChemSpide、Pubchem等數據庫進行匹配，參考相關文獻信息及與對照品比對等方式，最終從木芙蓉花中鑒別出54個化學成分，質譜信息和結構見表1和圖3。54個成分中黃酮及其苷類成分25個，有機酸類14個，香豆素類成分4個，氨基酸類2個，核苷類2個，生物堿類2個，其他類5個，其中12個化合物經過對照品比對后得到明確標識。

圖1 木芙蓉花90%乙醇提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS正離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 90% ethanol extract of Hibiscus mutabilis flowers by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in positive ion mode

圖2 木芙蓉花90%乙醇提取物的UPLC-Q-Orbitrap HRMS負離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of 90% ethanol extract of Hibiscus mutabilis flowers by UPLC-Q-Orbitrap HRMS in negative ion mode

圖3 木芙蓉花化合物的結構Fig.3 Compounds structures of Hibiscus mutabilis flowers

3.1 黃酮類及其苷類化合物鑒定

黃酮及其苷類成分為木芙蓉花的主要化學成分，本實驗從木芙蓉花中鑒定了黃酮醇(峰34、42、46)，以槲皮素、山奈酚、異鼠李素等為母核黃酮苷(峰20、21、24、25、27～29、31～33、35、39～41、43)，二氫黃酮(峰25、36、45)，黃酮(峰30、50、51)，異黃酮類(峰49)化合物共25個。

黃酮醇糖苷類化合物易發生糖苷鍵斷裂，丟失葡萄糖殘基、鼠李糖殘基或是木糖殘基等碎片后形成黃酮醇苷元，而后苷元可繼續丟失CO2、H2O等碎片離子或是發生逆狄爾斯-阿爾德(RDA)裂解，形成[1,3A]-、[1,4A]-、[1,3B]-、[1,4B]-等特征碎片離子[9]。例如化合物27在ESI-模式下的準分子離子峰m/z433.077 58，在二級質譜中，丟失了阿拉伯糖殘基形成槲皮素特征離子m/z301.035 03、300.027 31，苷元離子脫去H2O、CO等中性碎片形成碎片離子m/z283.024 57、271.024 63、255.029 65、227.034 81；或者發生RDA裂解，脫去C8H6O3，生成特征碎片離子m/z151.002 85[1,3A]-。根據文獻信息[10]比對，推測該化合物可能為番石榴苷；化合物46在ESI-模式下的準分子離子峰m/z285.040 19，脫去CO、H2O、CO2后形成二級碎片離子m/z257.044 59、239.034 65、229.050 40、211.039 08；或是C4-C10鍵斷裂形成碎片m/z243.028 61。根據文獻信息[11]及與對照品比對，確定該化合物為山奈酚，裂解途徑見圖4。

圖4 山奈酚的質譜裂解途徑Fig.4 Fragmentation pathway of kaempferol

黃酮、異黃酮類化合物二級質譜裂解過程中易丟失CO、CO2等，鄰位羥基取代還易失去H2O，若有甲氧基取代的時候，則優先連續丟失CH3，然后丟失CO。例如化合物50在ESI-模式下的準分子離子峰m/z373.092 62，二級質譜產生的碎片離子m/z358.069 27、343.045 75、328.022 28、300.027 19、285.003 94、257.009 09、229.013 26。根據數據庫檢索及與文獻信息[12]比對，確定該化合物為蔓荊子黃素。

二氫黃酮類化合物易丟失H2O、CO等中性碎片離子或是發生RDA裂解。例如化合物26在ESI-模式下的準分子離子峰m/z303.144 81，脫去H2O、CO2后形成二級質譜產生的碎片離子m/z285.040 31、259.061 61、241.049 67；或發生RDA裂解生成[1,4A]-、[1,4B]-特征碎片離子m/z178.997 74和m/z124.015 70。根據數據庫檢索及與文獻信息[10]對比，確定該化合物為二氫槲皮素。

3.2 有機酸類成分

從木芙蓉花中共鑒別有機酸類成分14個(峰2、6、7、9、11、12、15、16、18、19、23、37、38、48)，二級質譜裂解特征通常易失去H2O、CO、CO2、CH2等中性碎片且大多在負離子模式下有較好響應?；衔?8在ESI-模式下的準分子離子峰為m/z137.023 50，二級質譜產生的碎片離子m/z93.033 54。根據文獻信息[13]及與對照品比對，確定化合物為水楊酸，裂解途徑見圖5。

圖5 水楊酸的質譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathway of salicylic acid

3.3 香豆素類成分

從木芙蓉花中共鑒別香豆素類成分4個(峰13、14、17、47)，其二級質譜裂解過程中易丟失CO、H2O、CH3等中性分子，化合物13在ESI+模式下的準分子離子峰m/z193.049 47，二級質譜產生的碎片離子m/z178.026 02、165.054 75、133.028 38。根據數據庫檢索及與文獻信息[14]比對，確定化合物為東莨菪內酯，裂解途徑見圖6。

圖6 東莨菪內酯的質譜裂解途徑Fig.6 Fragmentation pathway of scopoletin

3.4 核苷類成分

從木芙蓉花中共鑒別2個核苷類成分(峰4、8)，化合物4在ESI+模式下的準離子峰為m/z268.103 94，在二級質譜中，丟失一分子呋喃核糖殘基形成m/z136.061 68碎片離子。根據文獻信息[15]及與對照品比對，確定該化合物為腺苷，裂解途徑見圖7。

圖7 腺苷的質譜裂解途徑Fig.7 Fragmentation pathway of adenosine

3.5 氨基酸類成分

從木芙蓉花中共鑒別2個氨基酸類成分(峰7、12)，二級質譜裂解特征通常為連續丟失NH3、H2O、HCOOH等碎片，化合物10在ESI+模式下的準分子離子峰為m/z166.086 07，二級質譜產生的碎片離子有m/z149.059 62、131.049 18、120.080 87、103.054 54。根據文獻信息[16]及與對照品比對，確定該化合物為L-苯丙氨酸，裂解途徑見圖8。

圖8 L-苯丙氨酸的質譜裂解途徑Fig.8 Fragmentation pathway of L-phenylalanine

3.6 生物堿類成分

從木芙蓉花中共鑒別2個生物堿類成分(峰1、44)，化合物1在ESI+模式下的準分子離子峰為m/z118.086 45，丟失一分子CH2和COOH后形成二級碎片離子m/z59.073 62。根據文獻信息[17]及與對照品比對，確定該化合物為甜菜堿，裂解途徑見圖9。

圖9 甜菜堿的質譜裂解途徑Fig.9 Fragmentation pathway of betaine

3.7 其他類

從木芙蓉花中共鑒別5個其他類成分(峰3、22、52、53、54)，化合物3在ESI-離子模式下的準分子離子峰為m/z341.109 86，二級質譜產生的碎片離子有m/z179.055 25、161.044 68、119.034 12。根據數據庫檢索及與文獻信息[14]比對，確定該化合物為蔗糖。

4 討論與結論

近年來，UPLC-Q-Orbitrap HRMS技術以其高分辨率、高質量精度、定性定量快速準確等優點廣泛應用于中藥化學成分分析及復雜多成分質量控制等領域。本實驗選用0.1%甲酸水-乙腈為流動相對木芙蓉花化學成分進行梯度洗脫，為更好的探究木芙蓉花的化學成分，選用正、負兩種離子掃描方式進行數據采集。根據現有文獻報道的保留時間、相對分子量、準分子離子峰、二級質譜碎片離子，結合二級質譜裂解規律以及化學對照品質譜信息等，對各質譜峰進行歸屬分析，從木芙蓉花乙醇提取液中共檢測到7類成分(黃酮及其苷類、有機酸類、香豆素類、氨基酸類、核苷類、生物堿類等)，共54個化合物。結合文獻以及scifinder數據庫發現其中33個成分首次在木芙蓉中報道，11個成分首次在木槿屬中報道。在花中新發現的11個黃酮類成分，例如廣寄生苷和番石榴苷通過降低游離脂肪酸的釋放[18]、柚皮素-7-O-葡萄糖苷通過激活PPARγ受體和磷酸化PI3K/AKT信號通路表現出降糖作用[19]；蔓荊子黃素可通過下調PI3K/Akt信號通路抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲[20]、與微管蛋白結合來促使MCF7乳腺癌細胞G2/M期阻滯[21]，廣寄生苷、野鳶尾黃素通過抑制PI3K/AKT信號通路[22]、ROS介導的線粒體功能性障礙[23]來誘導MDA-MB-231細胞凋亡；櫻桃苷對中波紫外線(UVB)導致的人角質細胞(HaCaT)損傷[24]有修復作用等，對于木芙蓉花臨床應用的拓展具有一定的意義。從構效關系來看，黃酮類成分的抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性主要受羥基化程度、C2-3位雙鍵、糖基以及母核結構的影響，木芙蓉花黃酮種類眾多，結構多樣性強，具有生物活性多樣性。本文完善了木芙蓉的化學成分庫，為后續木芙蓉花的開發利用、藥效物質基礎研究、質量控制等提供了依據。

木芙蓉是一種常用中藥，木芙蓉葉收載于2020版《中國藥典》[25]，且葉和花均可以入藥。本實驗與已報道的木芙蓉葉[11]化學成分對比，相同的黃酮類成分有14個，有機酸和香豆素類成分5個，體現了同一藥用植物不同部位中的化學成分具有一定的相似性。此外，木芙蓉花中某些已知成分未在此次分析中檢測到，可能與ESI的離子化效率有關；同分異構體化合物的鑒定一直以來都是質譜分析中的難點，因此僅通過質譜來進行指認具有一定的局限性，需要核磁共振等波譜分析進一步確認。通過觀察總離子流圖，可以發現在保留時間11～17 min鑒別出化合物較少，因此為了進一步了解該段化合物的組成，我們可以采用不同極性溶劑對其進行部位萃取，通過用相同高效液相色譜條件進行色譜峰分析，尋找其可能存在的極性部位，這也可為我們后續對木芙蓉花進行以化合物分離為手段的物質基礎研究起到一定指示作用。