當歸多糖抑制PI3K/AKT途徑阻礙平滑肌細胞增殖遷移

高雪亮，秦立鵬，李永章*，李愛英

1河北省中醫院，石家莊 050011；2河北中醫學院，石家莊 050200

冠狀動脈疾病(coronary artery disease，CAD)是最常見的心血管疾病類型之一，具有很高的發病率和死亡率。經皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是一種非常重要的CAD微創治療方法，PCI可有效改善冠脈血流量，降低心絞痛，極大地提高了病人的生活質量。然而，血管成形術后血管再狹窄(vascular restenosis，RS)的高發生率往往影響其長期治療效果。已有研究表明，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)的增殖和遷移是血管成形術后血管再狹窄發展的關鍵因素[1]。血管內皮損傷后，中膜的VSMCs在多種生長因子、細胞因子、炎癥介質的作用下，由收縮型轉化為合成型，并向內膜下遷移，發生過度增殖則是新生內膜形成的關鍵環節。因此，有效抑制VSMCs增殖和遷移已成為血管再狹窄防治的重點。當歸多糖是中藥當歸的主要生物活性成分，在抗炎癥、抗腫瘤和免疫調節等方面具有重要作用[2,3]。然而，當歸多糖在抗RS作用尚未見報道。本實驗采用當歸多糖處理人VSMCs(hVSMCs)，觀察VSMCs增殖、遷移和侵襲的狀態，并探尋當歸多糖調節VSMCs功能的可能分子機制，為血管再狹窄的早期干預治療提供策略。

1 材料

1.1 細胞

hVSMCs購自購自上海中國科學院細胞庫。

1.2 藥物

當歸多糖(西安雨澤生物科技有限公司，UV>98%)；血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ，美國Sigma-Aldrich公司)；肝素結合表皮生長因子(HB-EGF，美國R&D Systems公司)。

1.3 試劑

DMEM培養基(美國Invitrogen公司，12100-046)；胎牛血清(素爾生物科技有限公司，SH30084.03)；RIPA裂解緩沖液(南京森貝伽生物科技有限公司，SBJ-0999)；BCA試劑盒(上海易色醫療科技有限公司，BC201)；MMP2(ab92536)、MMP9(ab76003)、PI3K(ab139307)、p-PI3K(ab278545)、AKT(ab8805)和p-AKT(ab38449)抗體(美國Abcam公司)；HRP二抗(美國Abcam公司，ab6721)；牛血清白蛋白(BSA，上海源葉生物科技有限公司，B20923)；ECL化學發光底物試劑盒(廣州賽國生物科技有限責任公司，WBKLS0100)。

1.4 儀器

蛋白電泳設備(美國Bio-Rad公司，164-5052 和165-8001)；凝膠成像系統(美國Thermo Fisher公司，iBright CL1500)；細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司，CytomatTM10 C450)；酶標儀(美國Thermo Fisher公司，51119180ET)；光學顯微鏡(日本Olympus公司，CKX53)；臺式低溫離心機(美國Thermo Fisher公司，MICRO17R)。

2 方法

2.1 細胞培養

hVSMCs培養在含體積分數為10% FBS的DEME培養基中進行連續傳代培養。每隔2～3天進行細胞換液，每隔4天進行細胞傳代。

2.2 當歸多糖的制備

取當歸的水煮醇沉淀物和熱蒸餾水(1∶1)溶解，用氫氧化鈣飽和液調pH值為10.0～11.0，放置過夜，抽濾。濾液用5 mol/L硫酸調pH值為5.0～6.0，冰存過夜，抽濾，濾液過陰陽離子混合樹脂(樹脂體積之比為2∶1)交換，交換液濃縮至一定體積，加乙醇沉淀，使含醇量達85%，冰存過夜，抽濾。將醇沉物揮發掉乙醇并濃縮至稠膏狀，低溫干燥即得當歸多糖。

2.3 當歸多糖含藥血清的制備

四組4月齡SD雄性大鼠，每組5只，共20只。每天灌胃給藥當歸多糖低、中、高劑量(100、200、400 mg/kg)1次，連續1周，空白血清組給予等量的蒸餾水。第7天給藥1 h后，靜脈注射戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉大鼠，心臟取血，靜置后離心取上清，0.22 μm無菌濾器過濾分裝，56 ℃水浴鍋中30 min滅活補體。-20 ℃冰箱保存備用。用于體外實驗的含藥血清按照1∶4稀釋后使用，即當歸多糖低、中、高劑量的含藥血清實際添加濃度分別為25、50、100 mg/kg。

2.4 細胞分組

檢測當歸多糖血清對人血管平滑肌細胞(hVSMCs)的毒性作用。設置空白組(Blank)和不同濃度當歸多糖血清(100、200、400 mg/kg)組。A0為100 mg/kg當歸多糖血清，用于后續研究。

檢測當歸多糖血清對血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)和肝素結合表皮生長因子(HB-EGF)誘導的hVSMCs細胞特性的影響。設置空白(Blank)組，Ang Ⅱ(1 ng/mL)誘導+空白血清組，HB-EGF(1 ng/mL)誘導+空白血清組，Ang Ⅱ+當歸多糖血清(A0)組和HB-EGF+當歸多糖血清(A0)組。

研究當歸多糖血清通過調節PI3K/AKT途徑對Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的VSMCs增殖和遷移的影響。設置空白(blank)組，Ang Ⅱ+當歸多糖血清(A0)組，HB-EGF+當歸多糖血清(A0)組，Ang Ⅱ+當歸多糖血清(A0)組+ PI3K/AKT激動劑(IGF-1，10 μM)組和HB-EGF+當歸多糖血清(A0)組+IGF-1組。

2.5 指標檢測

2.5.1 hVSMCs增殖能力檢測

使用CCK-8試劑盒檢測hVSMCs增殖能力。取對數期生長至90%的各組細胞，PBS洗滌后用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，調節細胞懸液濃度為7×104/mL，然后以100 μL/每孔接種于96孔板，每組設6個平行孔，接種的細胞置于37 ℃、5% CO2條件下孵育48 h。培養結束后，去除每個孔中原有培養基，用無血清新鮮培養將CCK-8溶液按照10∶1的比例進行稀釋并混勻，每孔加入100 μL，輕輕敲擊培養板混勻，然后置于培養箱中繼續孵育1 h。利用酶標儀檢測各組450 nm處吸光度。

2.5.2 hVSMCs遷移能力檢測

使用細胞劃痕實驗檢測hVSMCs遷移能力。對數期生長至90%的hVSMCs用0.25%的胰酶消化細胞，使用Ang Ⅱ和HB-EGF誘導細胞；調整細胞濃度至5.0×104個/mL，每孔2 mL細胞懸液加入6孔板；細胞培養至100%融合狀態，加入1 μg/mL的絲裂霉素C，處理時間為1 h；使用200 μL移液器吸頭在每孔細胞表面劃一道直線，PBS沖洗劃掉細胞碎片；處理后的細胞除對照組，加入最適濃度的當歸多糖血清，將細胞置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養；分別在0 h和24 h倒置顯微鏡拍照并計算細胞侵襲距離。

2.5.3 hVSMCs侵襲能力檢測

使用Transwell小室檢測hVSMCs侵襲能力。從-20 ℃冰箱中取出Matrigel基質膠，將其置于4 ℃冰箱過夜融化收集各組對數期細胞，PBS洗滌，用胰酶消化制成單細胞懸液，用無血清的MEM培養基調節細胞密度1×105/mL，將Transwell小室放置在24孔培養板中，上室加入200 μL/孔，Transwell下室加入600 μL含10%血清的DMEM培養基，將24孔板置于細胞培養箱中，于37 ℃、5% CO2條件下繼續培養48 h后，取出小室，PBS洗滌后置于4%多聚甲醛中固定20 min，后加入0.1%結晶紫染色30 min，PBS沖洗小室，室溫下自然干燥后顯微鏡下觀察細胞遷移數量。

2.5.4 Western blot 分析蛋白表達水平

取對數生長期的細胞，接種到6孔細胞培養板(2.5×105個/mL)，每孔2 mL，37 ℃、5% CO2過夜培養。分組處理后收集細胞。用RIPA裂解各組細胞，提取總蛋白。用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后按照適當比例加入一抗(MMP2，MMP9，PI3K，P-PI3K，AKT和P-AKT)于4 ℃封閉過夜，第二天加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL進行曝光，曝光顯色后的蛋白使用Bio-Rad全功能成像系統采集圖像，Image-Pro Plus分析光密度，以β-actin為內參，計算各組蛋白質的相對表達量。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 當歸多糖血清對hVSMCs的毒性作用

由圖1可知，與空白組比較，100 mg/kg和200 mg/kg當歸多糖血清處理細胞后不會影響細胞活力，使用400 mg/kg當歸多糖血清處理細胞，細胞活力顯著下降(P<0.05)。因此，本實驗選擇100 mg/kg(A0)的當歸多糖血清濃度用于后續研究。

圖1 當歸多糖對hVSMCs活力的影響Fig.1 The effect of Angelica polysaccharides on the viability of hVSMCs 注：與空白組比較，* P < 0.05。Note:Compared with blank group, *P < 0.05.

3.2 當歸多糖抑制Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs的增殖，遷移和侵襲

如圖2所示，Ang Ⅱ和HB-EGF成功誘導了hVSMCs增殖，當歸多糖血清預處理顯著抑制Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs的增殖。另外，當歸多糖血清預處理顯著阻礙了由Ang Ⅱ和HB-EGF成功誘導的hVSMCs遷移和侵襲水平的增加(圖3A、3B)。Western blot實驗結果表明，在Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs中，遷移相關蛋白MMP2和MMP9的表達水平顯著升高，而當歸多糖血清預處理可以降低MMP2和MMP9的水平(圖4A～4C)。

圖2 當歸多糖對Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs活力的影響 Fig.2 The effects of Angelica polysaccharides on the proliferation of hVSMCs induced by Ang Ⅱ and HB-EGF注：與空白組比較，***P < 0.001；與Ang Ⅱ組比較，##P < 0.01。Note:Compared with blank group, *** P < 0.001;Compared with Ang Ⅱ group,## P < 0.01.

圖3 當歸多糖對Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs侵襲和遷移的影響 Fig.3 The effects of Angelica polysaccharides on the invasion and migration of hVSMCs induced by Ang Ⅱ and HB-EGF注：A：Transwell小室檢測hVSMCs遷移能力；B：劃痕實驗檢測hVSMCs侵襲能力。與空白組比較，***P < 0.001；與Ang Ⅱ組比較，###P < 0.001；與HB-EGF組比較，&&&P < 0.001。Note:A:The migration ability of hVSMCs was measured by Transwell assay;B:The invasion ability of hVSMCs was detected using Wound Healing.Compared with blank group, *** P < 0.001;Compared with Ang Ⅱ group,### P < 0.001;Compared with HB-EGF group,&&&P < 0.001.

圖4 當歸多糖對Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs中MMP2和MMP9表達的影響 Fig.4 The effects of Angelica polysaccharides on the expression of MMP2 and MMP9 in Ang Ⅱ and HB-EGF-induced hVSMCs 注：與空白組比較，*P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001；與Ang Ⅱ組比較，#P < 0.05；與HB-EGF組比較，&P < 0.05。Note:Compared with blank group, *P < 0.05,**P < 0.01,***P < 0.001;Compared with Ang Ⅱ group,#P < 0.05;Compared with HB-EGF group,&P < 0.05.

3.3 當歸多糖調控PI3K/AKT信號途徑

如圖5A～5E所示，在Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMCs中，p-PI3K和p-AKT的表達水平顯著升高，而當歸多糖血清預處理可以抑制p-PI3K和p-AKT的表達。PI3K和AKT的表達水平在各組細胞中沒有顯著變化。

3.4 當歸多糖通過抑制PI3K/AKT途徑對hVSMCs增殖，侵襲和遷移的影響

圖5 當歸多糖對PI3K/AKT信號途徑的調控作用 Fig.5 The regulation of Angelica polysaccharides on PI3K/AKT signaling注：與空白組比較，**P < 0.01；與Ang Ⅱ組比較，#P < 0.05，#P < 0.01；與HB-EGF組比較，&&P < 0.01 Note:Compared with blank group, **P < 0.01;Compared with Ang Ⅱ group,#P < 0.05,##P < 0.01;Compared with HB-EGF group,&&P < 0.01

如圖6和圖7所示，PI3K/AKT激動劑IGF-1處理逆轉了當歸多糖血清預處理對hVSMCs增殖、遷移和侵襲水平的抑制作用。Western blot實驗結果表明，與單獨使用當歸多糖血清預處理的hVSMCs相比，IGF-1和當歸多糖血清共處理的hVSMCs中，遷移相關蛋白MMP2和MMP9的表達顯著升高(見圖8)。

圖6 當歸多糖通過抑制PI3K/AKT途徑阻礙hVSMCs增殖Fig.6 Angelica polysaccharides inhibited the proliferation of hVSMCs by suppressing the PI3K/AKT pathway注：與HB-EGF+A0組比較，##P < 0.01；與Ang Ⅱ+A0組比較，&&&P < 0.001。Note:Compared with HB-EGF+A0 group,## P < 0.01;Compared with Ang Ⅱ+A0 group,&&& P < 0.001.

圖7 當歸多糖通過抑制PI3K/AKT途徑阻礙hVSMCs侵襲和遷移Fig.7 Angelica polysaccharides inhibited the invasion and migration of hVSMCs by suppressing the PI3K/AKT pathway注：A：Transwell小室檢測hVSMCs遷移能力；B：劃痕實驗檢測hVSMCs侵襲能力。與HB-EGF+A0組比較，###P < 0.001；與Ang Ⅱ+A0組比較，&&&P < 0.001。Note:A:The migration ability of hVSMCs was measured by Transwell assay;B:The invasion ability of hVSMCs was detected using Wound Healing.Compared with HB-EGF+A0 group,###P < 0.001;Compared with Ang Ⅱ+A0 group,&&&P < 0.001.

圖8 當歸多糖通過抑制PI3K/AKT途徑阻礙MMP2和MMP9的表達Fig.8 Angelica polysaccharides inhibited the expression of MMP2 and MMP9 by suppressing the PI3K/AKT pathway注：與HB-EGF+A0組比較，# P < 0.05，## P < 0.01；與Ang Ⅱ+A0組比較，& P < 0.05，&& P < 0.01Note:Compared with HB-EGF+A0 group,# P < 0.05,## P < 0.0;Compared with Ang Ⅱ+A0 group,& P < 0.05,&& P < 0.01.

4 討論與結論

中藥活性物質由于具有較少的副作用，長期以來被用于預防PCI后的血管再狹窄。當歸多糖作為當歸的主要活性成分，具有抗氧化、抗腫瘤、造血調節、免疫調節和神經保護等多種重要的生物活性。研究發現，當歸多糖可以通過調節骨髓造血干細胞改善骨髓造血微環境[4]。另外，當歸多糖通過抑制氧化應激和肝細胞凋亡，可以改善過量對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)所致的大鼠急性肝損傷[5]。機制上，當歸多糖生物活性的發揮可通過調節多種信號途徑實現。當歸多糖通過下調BNIP3和激活mTOR和Notch信號通路調節缺氧誘發的大鼠神經干細胞的凋亡和自噬[6]。最新研究發現，當歸多糖通過調節p38信號通路抑制宮頸癌Hela細胞生長、遷移和侵襲[2]。然而，當歸多糖對血管平滑肌細胞增殖和損傷血管修復的作用及潛在機制尚未見研究。在本研究中，我們發現當歸多糖血清在體外顯著抑制Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMC增殖、遷移和侵襲。并進一步證明當歸多糖血清對hVSMC增殖、遷移和侵襲的抑制作用是通過抑制PI3K/AKT信號通路中的蛋白活性來實現的。

眾所周知，Ang Ⅱ是一個是動脈粥樣硬化、高血壓和血管再狹窄的已知致病因素。據報道，高水平的HB-EGF與支架內再狹窄的高風險發生率相關[7]。本研究結果顯示，Ang Ⅱ和HB-EGF可顯著誘導hVSMC增殖、遷移和侵襲的發生。值得注意的是，當歸多糖可以顯著降低Ang Ⅱ和HB-EGF誘導的hVSMC增殖、遷移和侵襲水平。此外，一些遷移調節蛋白，包括細胞粘附分子ICAM1、VCAM-1、MMP2和MMP9被報道為異常VSMC遷移的重要調節蛋白。MMPs，尤其是MMP2和MMP9，在血管損傷后被快速激活。本研究結果表明當歸多糖血清可以抑制Ang Ⅱ和HB-EGF刺激誘導的MMP2和MMP9的表達。

PI3K/AKT信號通路廣泛調節細胞免疫、增殖、分化和凋亡過程[8]。已有研究報道，PI3K/AKT信號通路在激活hVSMC增殖和遷移，并在血管損傷后新生內膜增生中發揮重要作用[9,10]。PI3K/AKT信號通路的激活可導致支架內血管再狹窄的發生[11]。相反，含AKT1 siRNA的納米顆粒洗脫支架能夠有效緩解支架內再狹窄[12]。在總動脈支架植入動脈模型中，吉非替尼涂層球囊可通過抑制PI3K/AKT信號通路而抑制VSMC增殖并促進細胞凋亡[13,14]。還有實驗發現，用PDGF刺激人肺動脈VSMCs，可激活PI3K，PI3K通過使AKT下游的核糖體蛋白p7OS6K磷酸化，進而調節核糖體S6蛋白，從而促進VSMCs增殖和遷移，且IGF-1能有效抑制這一過程，證明PDGF誘導VSMCs的增殖和遷移呈PI3K依賴性[15]。Zhou等[16]在體外模擬支架植入后VSMCs受到的力學刺激，發現鼠VSMCs加載5%和20%的潛力6 h可激活PI3K/AKT信號通路和下游的GSK。另外，人參皂苷R1通過PI3K/Akt信號通路抑制VSMC增殖、遷移和新生內膜增生[17]。本研究發現，PI3K/Akt信號通路激動劑IGF-1可逆轉當歸多糖血清對hVSMC增殖，遷移和侵襲的抑制作用。

綜上所述，當歸多糖血清可成功抑制Ang Ⅱ和HB-EGF刺激的hVSMC增殖，遷移和侵襲的增加，其重要的作用機理之一是降低了PI3K/Akt信號通路的活性，本研究為抗血管再狹窄提供了新的治療策略。