苦豆子總堿降血糖作用及其機制研究

劉 偉，張揚星，楊新洲，歐陽艷，趙 平*

1伊犁師范大學新疆維吾爾自治區教育廳高校天然產物化學與應用重點實驗室，伊寧 835000；2中南民族大學，武漢 430074

糖尿病是一組由于胰島素分泌或胰島素作用缺陷引起的以高血糖和最終糖尿癥為特征的代謝性疾病[1]。研究數據統計在2017年全球糖尿病患者人數為8.51億，90%以上都為2型糖尿病(T2DM)[2]。T2DM是一種復雜的代謝失調疾病，其特征是慢性高血糖和不同程度的胰島素抵抗(IR)[3,4]。引起IR的原因之一是葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)蛋白的表達和功能的失調[5]。胰島素可以刺激骨骼肌葡萄糖攝取，主要是通過誘導GLUT4從細胞內儲存位置向質膜移位，GLUT4向細胞表面的轉運缺陷是2型糖尿病胰島素抵抗的一個關鍵特征[6]。因此，了解GLUT4的轉位和表達機制對防治糖尿病有著極為重要的作用，也表明其是潛在糖尿病治療的藥物靶點[7]。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)作為豆科槐屬多年生草本植物，廣泛分布于中國西北部各省和中亞國家，具有清熱解毒、祛風解渴等功效[8]，成為了西北地區常用少數民族藥材。生物堿是苦豆子中主要的化學成分之一，多數的化學與藥理學研究是圍繞苦豆子中的生物堿成分展開的[9,10]。苦豆子中的多數生物堿屬于喹諾里西啶生物堿，是屬于哌啶或吡啶的衍生物[11]，在抗炎、抗心律失常、抗腫瘤和免疫調節等方面具有重要的藥理活性和應用前景[12]。近年來，有研究表明從苦豆子中提取出的總生物堿能夠對DSS誘導的結腸炎小鼠有保護作用，可減輕結腸損傷，防止腸道微生物群失調，調節膽酸代謝[13]。現有關于苦豆子總堿在糖尿病方面的研究還較少，因此，本實驗通過提取苦豆子中總堿，研究其降血糖效果及相關作用通路，以期充分利用苦豆子藥用資源價值，為研究抗糖尿病藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器

Thermo Forma 371直熱式CO2細胞培養箱(Thermo Fisher公司)；Olympus IX 81倒置顯微鏡(Olympus公司)；Tecan M200 PRO多功能酶標儀(Tecan公司)；DYY-6C型電泳儀(北京市六一儀器廠)；Rio-Rad Chemidoc XRS化學發光凝膠成像系統(Bio-Rad公司)；LSM700 激光共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)。

1.2 藥品與試劑

苦豆子地上部分于2018年7月采于新疆伊犁，經中南民族大學藥學院萬定榮教授鑒定為苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)的地上部分，植物樣本保存于中南民族大學標本館。

BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，Lot：082820201207)；PAGE凝膠快速制備試劑盒(10%)(上海雅酶生物醫藥科技有限公司，Lot：04542025)；葡萄糖(GLU-OX)檢測試劑盒(氧化酶法)(英科新創有限公司，Lot：7008240303)；特靈敏ECL化學發光試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，Lot：121720210418)；MTT(德國BioFroxx公司，Lot：EZ2811A179)；Anti-Akt、Anti-p-Akt、Anti-β-actin、Anti-GLUT4、Anti-AMPKα、Anti-p-AMPKα、Anti-p-PKC(pan)(Cell signaling technology公司，Lot：28、30、18、7、21、2、2)；HRP-goat anti rabbit IgG、HRP-goat anti mouse IgG(CWBIO 公司，Lot：01332/40242；00393/50537)；α-Minimal Essential Medium(α-MEM，美國Gibco公司，Lot：8121273)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，Lot：19050501)。

PSS生理鹽溶液：135 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl2，1 mM MgCl2，10 mM HEPES，10 mM Glucose，加水定容至1 L，用5 mol/L NaOH調節pH至7.4。

1.3 細胞

L6-myc-GLUT4-mOrange細胞：穩定表達轉染了紅色熒光蛋白myc-GLUT4-mOrange的L6骨骼肌細胞。

1.4 方法

1.4.1 苦豆子總堿的提取

取干燥的苦豆子地上部分1 kg，粉碎，用95%的乙醇室溫下提取4次，合并多次提取液，減壓濃縮至無醇味即得浸膏150 mL。將浸膏加200 mL熱蒸餾水分散后，加10% H2SO4調pH至2～3左右，然后用石油醚萃取多次除去脂肪酸等小極性成分，之后將溶液加氨水調節至pH值為10左右，再次用乙酸乙酯萃取多次得苦豆子總生物堿部位(TASA，23 g)。

1.4.2 L6骨骼肌細胞的培養和誘導分化

將穩定表達轉染了紅色熒光蛋白myc-GLUT4-mOrange的L6骨骼肌細胞在含10%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養基于37 ℃，5% CO2條件下培養，當細胞生長至80%左右，換為含2%胎牛血清和1%雙抗的α-MEM培養基進行誘導分化。隔天換液，誘導分化培養5～7天，至80%的細胞生長出肌管，即得到分化成熟的成肌細胞。

1.4.3 L6骨骼肌細胞葡萄糖攝取實驗

為測定TASA對L6骨骼肌細胞葡萄糖攝取的刺激作用。首先，將L6骨骼肌細胞接種于96孔板中，每個實驗組設置10個重復孔，同時設置空白對照組(control,Con)、陽性對照胰島素組(insulin,Ins)和藥物組。待細胞匯合到80%左右后，換成含2%胎牛血清的α-MEM培養基分化5～7天。接下來將96孔板中培養的細胞用不含血清的α-MEM基礎培養基饑餓2 h，然后分別加入100 μL的15、30、60 μg/mL TASA(TASA-15、TASA-30、TASA-60)、100 nM胰島素和無血清α-MEM(空白對照)后，放入37 ℃，5% CO2的培養箱中培養30 min，另取一個新的96孔板，按照試劑盒說明書對每孔加入200 μL葡萄糖氧化酶試劑，并另取一排加入氧化酶試劑后加入2 μL葡萄糖標準液，從舊96孔板中一對一地取上清液2 μL加入到新板中，30 min內用酶標儀于505 nm處測量吸光值。

1.4.4 MTT法檢測TASA作用L6骨骼肌細胞藥物毒性

按照“1.4.3”方法加入無血清α-MEM培養基和不同濃度TASA作用L6骨骼肌細胞30 min后，吸去培養基及藥物，每孔加入100 μL用α-MEM稀釋的MTT溶液(5 mg/mL)，放入細胞培養箱避光培養4 h后，吸去MTT，再向每孔內加入150 μL DMSO溶液后，測量490 nm處吸光值。

1.4.5 激光共聚焦顯微鏡檢測L6骨骼肌細胞中GLUT4的轉運

當L6-myc-GLUT4-mOrange細胞長到適合傳代密度時，將其接種在經95%酒精滅菌后的無菌蓋玻片上，于培養箱中過夜培養使其完全的貼壁，然后利用不含血清的α-MEM基礎培養液饑餓細胞2 h后，再用PSS生理鹽溶液清洗，將饑餓的細胞放置在激光共聚焦顯微鏡之下，加入200 μL PSS生理鹽溶液，于555 nm激發波長下觀測myc-GLUT4-mOrange的熒光轉位的動態變化。觀察并記錄加入30 μg/mL TASA后5 min內myc-GLUT4-mOrange的熒光強度的變化，并計算GLUT4在胞內的轉運。

1.4.6 總蛋白的提取

將分化5～7天的細胞用無血清α-MEM基礎培養基饑餓2 h，然后分別加入陽性對照和不同濃度的TASA作用30 min后，立即將培養皿放于冰上，棄去含藥物的培養基．終止藥物的作用，并用預先在4 ℃預冷的PBS洗滌細胞3次后吸干，每皿加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液100 μL。用1 mL槍頭底部將細胞盡量均勻地刮起；并收集于1.5 mL EP管中，再依次用27孔徑和12孔徑注射器進行多次的抽提破碎30次，全部操作必須保持在冰上完成。利用冷凍離心機在4 ℃，12 000 rpm的條件下，對破碎后的細胞進行冷凍離心處理10 min，再小心地吸取上清，棄去沉淀，上清液即為細胞總蛋白。按照Beyotime BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書對蛋白濃度進行檢測。根據收集所得的蛋白濃度及體積，加入相對應體積的5×SDS-PAGE loading buffer，振蕩后置于95 ℃金屬加熱器上變性10 min，-20 ℃保存備用。

1.4.7 Western blot檢測GLUT4及相關信號通路蛋白表達情況

取等量蛋白質樣品上樣，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，并轉膜至NC膜，利用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，之后用TBST洗膜3次，每次10 min，再加入稀釋后的AKT、p-AKT、β-actin、GLUT4、AMPKα、p-AMPKα和p-PKC(pan)一抗，4 ℃搖床上孵育過夜。之后再用TBST洗膜3次，每次10 min，室溫搖床孵育稀釋的二抗1 h。使用ECL化學發光液顯色發光，凝膠成像系統顯影及配套軟件計算灰度值。

1.4.8 統計學處理

2 結果

2.1 TASA對L6骨骼肌細胞內葡萄糖攝取的影響

利用葡萄糖檢測試劑盒研究了TASA對于L6骨骼肌細胞內葡萄糖攝取的情況。如圖1所示，以Ins作為陽性對照，并設立空白對照組和實驗組，結果證明使用100 nM Ins和不同濃度的TASA分別處理L6細胞，兩者都能明顯促進L6細胞對葡萄糖的攝取。

圖1 不同濃度的TASA處理對L6細胞葡萄糖攝取的影響Fig.1 Effect of TASA with different concentrations on glucose uptake of L6 cells注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。NS表明無顯著性差異，下同。Note:Compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01,***P< 0.001.NS showed no significant difference The same below.

2.2 TASA對L6骨骼肌細胞的毒性影響

利用MTT法對TASA作用于L6骨骼肌細胞進行了細胞毒性檢測。結果如圖2所示，15、30、60 μg/mL濃度的TASA作用細胞30 min后，均對細胞無明顯毒性作用，說明TASA具有成為降糖藥的良好潛質。

圖2 TASA對L6細胞的毒性影響Fig.2 Toxic effect of TASA on L6 cells

2.3 TASA促進L6骨骼肌細胞內GLUT4的轉位

為進一步探究TASA促進L6骨骼肌細胞內葡萄糖攝取的作用機理，利用激光共聚焦顯微鏡監測L6-myc-GLUT4-mOrange細胞中myc-GLUT4-mOrange的熒光強度的動態變化，來反映L6骨骼肌細胞中GLUT4的轉位情況。如圖3A、3B所示(Basal是指基礎狀態，即加藥前狀態)，發現30 μg/mL TASA作用細胞1 min時即能顯著增加細胞膜上myc-GLUT4-mOrange熒光強度，且呈現時間依賴性，表明TASA能促進GLUT4易位到細胞膜上，進而促使L6骨骼肌細胞內葡萄糖攝取。

圖3 TASA處理對L6細胞內GLUT4的轉位(標尺：50 μm)Fig.3 Effect of TASA treatment on translocation of GLUT4 in L6 cells (scale:50 μm)注：A.Confocal監測L6-myc-GLUT4-mOrange細胞中myc-GLUT4-mOrange每分鐘熒光強度動態變化；B.加藥處理后相對應的熒光變化曲線。Note:A.Confocal was used to monitor the dynamic changes of fluorescence intensity per minute of myc-GLUT4-mOrange in L6-myc-GLUT4-mOrange cells;B.The corresponding fluorescence curve after the treatment of adding medicine.

2.4 TASA促進L6骨骼肌細胞中GLUT4的蛋白表達

利用Western blot檢測TASA作用L6骨骼肌細胞后GLUT4的蛋白表達情況，實驗結果發現，與對照組相比，加入100 nM胰島素的陽性對照組和分別加入15、30、60 μg/mL的TASA作用細胞30 min后能夠增加GLUT4的蛋白表達，且呈濃度依賴性(見圖4A、4B)。結果表明TASA能夠促進L6細胞中GLUT4的蛋白表達水平增加。

圖4 TASA處理對L6細胞內GLUT4蛋白表達影響Fig.4 Effect of TASA treatment on GLUT4 protein expression in L6 cells

2.5 TASA增強了L6骨骼肌細胞內AMPK和PKC信號通路的磷酸化水平

體內GLUT4細胞膜轉位受多種信號通路的影響，主要涉及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)信號通路、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路等。因此，本研究進一步驗證TASA促進GLUT4轉位和表達是通過哪種信號通路。由蛋白磷酸化實驗結果顯示，TASA能夠增加AMPK和PKC信號通路中蛋白的磷酸化水平，且呈濃度依賴性(見圖5A、5B)，但經TASA處理后的細胞的AKT磷酸化現象沒有顯著變化(見圖5C)。這些發現支持了TASA是通過AMPK和PKC信號通路促進GLUT4表達和轉位。

圖5 TASA通過促進L6細胞中AMPK和PKC信號通路的磷酸化誘導GLUT4表達Fig.5 TASA induced GLUT4 expression by promoting phosphorylation of AMPK and PKC signaling pathway in L6 cells注：A.100 μg/mL陽性藥二甲雙胍(MET)和不同濃度TASA處理細胞30 min后，其AMPK磷酸化水平顯著升高；B.200 nM陽性藥佛波酯(PMA)和不同濃度TASA處理細胞30 min后，其PKC磷酸化水平顯著升高；C.不同濃度TASA處理細胞30 min后，對AKT磷酸化水平無影響。Note:A.The phosphorylation level of AMPK increased significantly after 100 μg/mL positive drug Metformin (MET) and different concentrations of TASA treatment for 30 min;B.The phosphorylation level of PKC increased significantly after 200 nM positive drug PMA and different concentrations of TASA treatment for 30 min;C.The phosphorylation of AKT was not affected by different concentrations of TASA for 30 min.

3 討論與結論

2型糖尿病(T2DM)是一種復雜的慢性糖代謝紊亂疾病，其發病率一直呈上升趨勢。目前針對2型糖尿病治療的傳統藥物主要是二甲雙胍、胰島素、磺脲類藥物及其他口服降糖藥，而新型的降糖藥主要有胰高血糖素樣肽1(GLP-1)受體激動劑、二肽基肽酶4抑制劑(DPP-4i)等[14]，這些藥物或多或少都存在一定的副作用。而從天然植物中提取的傳統藥物已被證明比現代藥物更經濟，臨床療效好且副作用相對較少[15]，因此尋求相對安全的藥用植物在糖尿病的治療中已變得越來越重要。

中藥治療糖尿病的主要成分按化學結構可分為生物堿類、多糖類、皂苷類、黃酮類等幾大類[16]。有研究表明，天然藥物生物堿類成分中具有顯著降血糖活性的異喹啉生物堿類小檗堿能增強胰島素誘導的糖攝取及GLUT4轉位，改善胰島素抵抗[17]。哌啶生物堿類胡椒堿通過激活L6細胞內AMPK上游通路，進而磷酸化AMPK誘導GLUT4轉位至質膜[18]。苦豆子總堿是從藥用植物苦豆子中提取出的堿類，其是含有槐果堿、槐定堿、苦參堿等多種生物堿的總稱[19]，現有的研究表明，苦豆子總堿在抗腫瘤、抗微生物、降血壓等[20]方面起著一定藥理作用，但還鮮有關于對糖尿病研究的報道。因此，本實驗從苦豆子地上部位提取出總堿來研究其降糖作用。

體內GLUT4細胞膜轉位受多種信號通路的影響，影響GLUT4轉位的一個重要通路是胰島素介導的信號效應通路，即胰島素可與胰島素受體(insulin receptor，IR)結合后，通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路調節糖原合成、葡萄糖的攝取和降解，從而發揮調節血糖的作用[21,22]。本實驗以L6細胞為研究對象，發現TASA作用細胞后的AKT磷酸化水平沒有顯著變化，說明TASA的降糖作用不影響AKT通路。骨骼肌葡萄糖攝取還可以通過胰島素非依賴性AMPK通路激活骨骼肌葡萄糖攝取和利用，其機理是AMPK被激活后，會引起TBC1D1的磷酸化，進而上調下游信號分子GLUT4的表達，并促進GLUT4從細胞內向細胞膜轉運，增加細胞對葡萄糖的吸收和利用[23]。PKC可分為多種激酶亞型包括典型PKC(PKC-α、PKC-β、PKC-γ)，新型PKC(PKC-ε、PKC-η、PKC-θ)和非典型PKC(PKC-ζ、PKC-λ)，研究結果表明使用PKC-ζ抑制劑后，胰島素刺激下的葡萄糖轉運受到抑制，而PKC-ζ的活化可增加葡萄糖轉運[24]。本實驗通過研究TASA對細胞AMPK和PKC通路影響，發現AMPK和PKC磷酸化水平均升高，提示TASA可能通過激活AMPK和PKC通路來進一步上調GLUT4表達。

綜上所述，基于GLUT4為作用靶點，本實驗圍繞TASA對GLUT4的表達和轉位作用展開研究，結果發現TASA能夠有效增加L6骨骼肌細胞內葡萄糖的攝取和GLUT4的轉位和表達，由進一步的機制研究發現TASA作用GLUT4的蛋白表達是通過AMPK和PKC兩種信號通路來促進。這些結果發掘出TASA在治療糖尿病方面的潛力。然而該研究還缺乏TASA在活體水平上的相關實驗，之后的研究將通過TASA作用于2型糖尿病小鼠模型來觀測其對活體模型的血糖及相關指標的影響。