高表達活化白細胞黏附因子對AZ-521胃癌細胞系增殖能力的影響

潘瓊 谷見法 劉松格 楊曉瑞

（鄭州市中心醫院腫瘤內科，河南 鄭州 450007）

目前胃癌的主要治療方式為手術切除，早期胃癌患者術后5年生存率可達90%以上，但因胃癌早期臨床癥狀不明顯，多數胃癌患者在確診時已處于中晚期，治療效果不盡人意[1]。活化白細胞黏附因子（Activated leukocyte cell adhesion molecule，ALCAM），即CD166是免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛存在于各組織器官，通過黏附作用介導細胞間的相互作用，參與多種生理過程以及腫瘤發生發展[2-3]。研究顯示 CD166在胃癌組織中呈高表達狀態[4]，但如何影響胃癌的發生尚不清楚。

故本文探討CD166對AZ-521胃癌細胞系增殖能力的影響，以期為進一步探討其參與胃癌發生、發展的分子機制提供初步的依據。

1 材料與方法

1.1 材料

裸鼠（6-8 w）購自北京維通利華實驗動物有限公司；總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自天根生物有限公司；2×SYBR Green qPCR Mix購自美國BIO-RAD公司；cDNA反轉錄試劑盒購自日本TAKARA公司；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司；兔抗人CD166兔多克隆抗體購自美國Abcam公司；β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；HRP標記的羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物有限公司；CCK-8試劑盒檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養

人胃癌細胞株 AZ-521購自南京科佰生物科技有限公司，接種于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養基中，于37℃，5%CO2恒溫箱中培養并傳代。

1.3 慢病毒包裝

pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒質粒由上海吉凱基因化學技術有限公司構建。將pLOX- WBmi1（15 μg）慢病毒空載體與pLOX-CWBmi1-CD166（15 μg）慢病毒重組載體分別與輔助質粒psPA X2（9.6 μg）和 Pmd2.G（5.4 μg）加入 600 μL pti-MEM中，取20 μL lipofectamine 200加入另一管600 μL Opti-MEM中混勻，靜置5 min，兩管Opti-MEM混合，室溫孵育20 min，轉染6 h后換液。48 h后加Puromycin（1 g·kg-1）篩選陽性細胞，同時設等密度對照細胞進行篩選。待對照 AZ-521細胞全部死亡后，感染細胞采用胰酶消化，并進行稀釋、克隆，待單克隆形成后，采用熒光定量PCR和Western blot進行測定。

1.4 熒光定量PCR測定CD166 mRNA表達水平

根據 CD166的 mRNA序列，設計熒光定量PCR 引物，CD166-F：5’-GATCTCCGCCACCGTCTTCA G-3’；CD166-R: 5’-CGTCGTACTGC ACACT TTTC-5’。合成的引物稀釋為10 nM。收集對照細胞和CD166過表達細胞，采用RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒提取RNA并逆轉錄為cDNA。然后按照下列體積建立 PCR 體系：2×SybGreen mix 10 μL, CD166-F/R 各 0.6 μL，cDNA 8.8 μL，總體積 20 μL。根據需要配置合適的體系，加入熒光定量PCR板中，在下述反應條件下進行PCR：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，循環數40次，PCR結束后建立溶解曲線，分析兩組mRNA水平。

1.5 Western blot分析CD166蛋白水平

收集對照細胞和CD166過表達細胞，加入1×上樣緩沖液，沸水煮20 min，將樣本測蛋白濃度后，取50 μg總蛋白上樣電泳，取出凝膠切取目的條帶，用蒸餾水沖洗，結束后將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉30 min后，用CD166兔多克隆抗體在 4℃孵育過夜，次日用PBST洗滌 3次，每次 5 min，結束后用羊抗兔HRP標記的抗體在室溫孵育1 h，結束后PBST洗滌3次，每次5 min，然后顯影觀察CD166蛋白表達情況。

1.6 CCK-8檢測細胞增殖

分別將處于對數生長期的 AZ-521對照細胞和CD166過表達細胞用胰蛋白酶消化后，接種于96 孔板中（8×103個·mL-1，每孔 100 μL），分別繼續培養12、24和48 h。待細胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續培養4 h后測定450 nm處吸光值。每個時間點設置3個復孔。

1.7 克隆形成測定

將處于對數生長期的 AZ-521對照細胞和CD166過表達細胞用胰蛋白酶消化后，分別取100個克隆接種于6孔板中，放置37℃培養箱中繼續培養，每隔2 d更換一次培養基。至第12 d時細胞克隆基本形成。棄培養基，經PBS洗滌后，室溫下甲醇固定10 min，清洗、風干后加入結晶紫染色液染色20 min。計數每皿細胞中50個細胞以上的克隆數目，每種細胞設置3個復孔。

1.8 動物腫瘤模型建立

將46只BALB/c雄性裸鼠（18～23 g）隨機分為對照組和CD166組（n=23），持續通過3.0%異氟烷氣體和30%氧氣混合進行吸入麻醉誘導后，均于小鼠左側腋下分別接種對照細胞、CD166過表達細胞，每日觀察并統計小鼠的成瘤狀況、腫瘤體積以及存活時間，連續統計30 d。

1.9 統計學分析

采用SPSS19.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差（±SD）的形式表示，組間樣本比較采用t檢驗；計數資料以率（%）來表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05表示樣本間差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 過表達CD166胃癌AZ-521細胞株構建

pLOX-CWBmi1-CD166慢病毒質粒感染后，AZ-521細胞中CD166蛋白的表達水平顯著升高(P＜0.05)，見圖1。

圖1 Western Blot測定CD166蛋白水平

2.2 過表達CD166對胃癌AZ-521細胞增殖的影響

經慢病毒感染胃癌AZ-521細胞12 h、24 h、48 h后，細胞數量均明顯增加 (P＜0.05)，但過表達CD166胃癌AZ-521細胞在各時間點的增殖活力均明顯高于對照組細胞 (P＜0.05)，見圖2。

圖2 CCK-8測定細胞增殖能力

2.3 吉姆薩染色檢測CD166過表達細胞克隆形成

與對照組細胞克隆形成數比較，CD166過表達細胞的克隆形成數明顯升高 (P＜0.05)，見圖3。

圖3 細胞克隆形成

2.4 動物模型成瘤情況

腫瘤建模對照組小鼠死亡率為4.35%，CD166組小鼠死亡率為8.70%，均建模成功，見表1。CD166組小鼠的腫瘤生長速度明顯快于對照細胞系 (P＜0.05)，見圖4。

圖4 小鼠腫瘤體積測定

表1 兩組小鼠死亡、存活情況對比（例（%），n=23）

3 討論

CD166屬于免疫球蛋白家族中的單鏈跨膜糖蛋白，是淋巴細胞抗原CD6的配體，廣泛分布于活化的白細胞、內皮細胞、單核細胞、神經元、造血干細胞、間葉組織干細胞等多種細胞中，參與機體的細胞黏附、造血、炎癥以及系統發育等多種生物學過程[5]。近年研究顯示，CD166參與多種腫瘤的發生及發展，對腫瘤細胞的生長和轉移具有調控作用[6-7]。目前發現，CD166在惡性黑色素瘤、胰腺癌、前列腺癌、結直腸癌以及乳腺癌中呈高表達狀態，并與腫瘤的生長和浸潤侵襲密切相關[8-9]，但尚未見胃癌組織中 CD166蛋白的研究。

本文研究發現，穩定表達CD166蛋白的AZ-521細胞的增殖速度明顯增加，細胞形成克隆率更高，在動物成瘤實驗中，CD166組小鼠成瘤體積顯著大于對照組小鼠同期的腫瘤體積，這表明過表達 CD166與腫瘤細胞的增殖存在密切的關系。這與文獻報道一致，即CD166表達于多種腫瘤細胞和腫瘤干細胞，在前列腺癌、乳腺癌、食管癌等多種惡性腫瘤的發生發展中起著積極的作用，并與多種臨床病理指標及預后相關[10]。

已有研究證明 CD166可能是通過以下途徑促進腫瘤發生和浸潤侵襲的：CD166可促進前體MMP（基質金屬蛋白酶）-2向活化MMP-2的轉變，而 MMP-2在細胞外基質和基底的降解中起著重要作用，細胞外基質的加速降解又促進了腫瘤的浸潤轉移[11]。但也有研究表明在某些腫瘤中CD166表達下調，可降低細胞的黏附能力以及能動性，從而促進腫瘤的遠處轉移[12]。因此CD166在不同腫瘤發生發展中所扮演的角色仍需進一步的研究和探索。

綜上所述，CD166高表達可促進胃癌細胞的增殖活力及生長速度，并顯著加速胃癌腫瘤的發生進程。這可能為未來胃癌腫瘤的早期鑒定、治療及預后提供一定的參考價值。