基于網(wǎng)絡藥理學探討白藜蘆醇抗衰老的作用機制#

曾宇鑫 汪夢 張曉 梁楠

（成都醫(yī)學院基礎醫(yī)學實驗教學中心，四川 成都 610500）

衰老主要表現(xiàn)為機體功能的衰退、身體適應力減退。全球人口老齡化的趨勢迫切需要人們更好地了解衰老的過程，從而找尋預防、延遲或減輕其發(fā)展的策略[1-2]。目前認為，氧化應激和炎癥激活是引起衰老的主要原因[3]。

白藜蘆醇（Resveratrol，Res）具有抗衰老、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]可用于治療多種與年齡有關的疾病，例如阿爾茨海默氏病[7-8]、血脂異常[9]，同時具有預防衰老延長壽命的作用[10-11]，然而其抗衰老的機制還不十分清楚。

網(wǎng)絡藥理學是基于藥物結構及其作用靶點與疾病相關靶點之間的生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡分析，可以預測藥物治療疾病的關鍵靶點和機制。因此，運用網(wǎng)絡藥理學研究Res抗衰老作用機制具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 Res作用靶點的獲取

在美國國家生物技術信息中心負責維護的Pubchems數(shù)據(jù)庫（https: //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中查找Res的3D化學結構。在華東理工大學開發(fā)與維護的藥效團匹配與潛在識別靶標平臺PharmMapper數(shù)據(jù)庫（http: //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）中[12]，通過Res的3D化學結構搜索目標僅為人類的相關蛋白質，以標準化擬合得分（Normalized Fit Score）≥0.4和z分數(shù)≥0.4為篩選條件，得到Res作用靶點，通過UniProt數(shù)據(jù)庫轉化為對應的基因名（Gene names）。

1.2 疾病相關靶點的獲取

GeneCard數(shù)據(jù)庫（https: //www.genecards.org/）收錄了關于人的蛋白質編碼基因、RNA基因、遺傳基因座、基因簇和未分類的基因等詳細信息，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中[13]，我們輸入關鍵詞衰老（Aging），以相關性得分（Relevance score）≥20.00為篩選條件查詢得到衰老相關靶點。

1.3 Res抗衰老靶點

在Venny圖在線繪制工具（https: // bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中，分別輸入搜索的Res作用靶點、衰老相關靶點到 Res、衰老下面的欄目，兩者之間的交集即為Res抗衰老的潛在靶點。

1.4 PPI網(wǎng)絡圖的構建與分析

將Res抗衰老的潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫（https: //string-db.org/）[14]，限定物種為人，置信度設置為0.4，制作蛋白互相作用（protein-pro tein interaction，PPI）圖后下載圖片和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)表格。統(tǒng)計各個基因在網(wǎng)絡數(shù)據(jù)表格中出現(xiàn)的次數(shù)，并繪制柱狀圖。

1.5 GO富集分析和KEGG通路分析

將Res抗衰老的潛在靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫（https: //david.ncifcrf.gov/）[15]，選擇物種為人，下載基因本體論中（Gene Ontology，GO）分析中的生物學過程（Biological Process，BP）、細胞成分（Cel-lular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）富集分析結果，并下載京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析結果，利用微生信在線繪圖網(wǎng)站（http: // www.bioinformatics.com.cn/）制作GO富集分析柱狀圖和KEGG通路分析氣泡圖。

1.6 構建“藥物-疾病-靶點-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡

將 Res抗衰老的潛在治療靶點，取前 20條KEGG通路分析結果、前10條GO（BP，CC，MF）富集分析結果導入Cytoscape3.8.0軟件，構建“藥物-疾病-靶點-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 Res作用靶點

從PharmMapper數(shù)據(jù)庫中獲得目標僅為人類的Res相關蛋白質總計224個。以標準化擬合得分（Normalized Fit Score）≥0.4和z分數(shù)≥0.4為篩選條件，篩選后經(jīng) UniProt數(shù)據(jù)庫轉換名稱后我們得到91個匹配靶點。

2.2 衰老相關靶點

我們從 GeneCard數(shù)據(jù)庫中獲得衰老相關靶點共有24457個，以Relevance score≥20.00為篩選條件，篩選后得到474個衰老相關靶點。

2.3 Res抗衰老潛在靶點分析

將Res作用靶點和衰老相關靶點取交集后，我們得到22個Res抗衰老的潛在靶點，見圖1，分別為 ESR1、ALB、NOS3、AR、ANXA5、EGFR、CDK6、SRC、NR3C2、SOD2、PTPN11、F2、SERPINA1、MAPK10、PLAU、ERBB4、MET、ARSA、JAK2、FGFR1、MAPK1、IGF1，見表1。

表1 Res抗衰老潛在靶點

圖1 Res抗衰老潛在靶點的Venny圖

2.4 PPI網(wǎng)絡分析

將Res潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫，分析PPI網(wǎng)絡圖，EGFR 、MAPK1、MET、ESR1、SRC、IGF1占據(jù)核心位置，見圖2。在PPI網(wǎng)絡中，靶點互相關聯(lián)節(jié)點數(shù)最高的 5名是 IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR，見圖3，并且它們都與SIRT1有聯(lián)系，見圖3。

圖2 Res抗衰老潛在靶點的蛋白相互作用網(wǎng)絡圖

圖3 PPI網(wǎng)絡中各個節(jié)點關聯(lián)度柱狀圖（左）和Res抗衰老潛在靶點的蛋白互相作用網(wǎng)絡圖（右）

2.5 GO富集分析

GO富集分析中的生物學過程分析結果前 3條分別為信號轉導、肽基酪氨酸磷酸化、磷脂酰肌醇 3-激酶信號的正調(diào)控；GO富集分析中的細胞定位分析結果前3條分別為細胞核、受體復合物、細胞外區(qū)；GO富集分析中的分子功能分析結果前3條分別蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質結合、磷脂酰肌醇-4, 5-二磷酸3-激酶活性，見圖4。

圖4 Res抗衰老潛在靶點的GO富集分析

2.6 KEGG通路分析

KEGG通路分析中前5條包含有：Ras、PI3KAkt、ErbB、Rap1、FoxO、GnRH、HIF-1信號通路，見圖5和表2。在PI3K-Akt信號通路、FoxO信號通路、HIF-1信號通路中都出現(xiàn)了 IGF1、MAPK1、EGFR，見表2。

表2 20條KEGG信號通路參數(shù)

圖5 Res抗衰老潛在靶點KEGG通路分析

2.7 構建“藥物-疾病-靶點-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡

將Res抗衰老的潛在治療靶點，取前20條KEGG通路分析，把前10條GO（BP，CC，MF）富集分析結果導入Cytoscape3.8.0軟件中構建“藥物-疾病-靶點-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡。在“藥物-疾病-靶點-GO-KEGG 通路”網(wǎng)絡圖中 EGFR、MAPK1和FGFR1處于核心位置，見圖6。這說明白藜蘆醇通過EGFR、MAPK1和FGFR1調(diào)節(jié)多條通路共同治療衰老。

圖6 “藥物-疾病-靶點-GO-KEGG通路”網(wǎng)絡圖

3 討論

細胞衰老能持續(xù)的對抗增殖反應，產(chǎn)生不經(jīng)歷細胞死亡的不可逆生長停滯狀態(tài)[16-17]，在驅動機體衰老過程中起關鍵作用[18]。根據(jù)激活信號的不同，可分為復制性衰老和過早衰老。復制性衰老其特征是有限的潛能復制，將其壽命限制在一定數(shù)量的細胞分裂中。目前已知這個過程是通過細胞端粒（染色體末端的TTAGGG重復序列）[19-20]縮短觸發(fā)信號誘導的[21]。另一方面，過早衰老是通過激活致癌基因、抑制基因失活、DNA損傷

和氧化應激等生物學作用實現(xiàn)的。Res有多種抗衰老作用，例如延緩血管衰老[22-23]以及劑量依賴性延緩細胞衰老[24]。Res在正常細胞和癌細胞中的作用是雙向的，低劑量的Res可以通過誘導早衰來阻止癌細胞的生長；然而，Res也能誘導正常原代細胞衰老。

為了尋找Res抗衰老的關鍵靶點，本文利用PharmMapper數(shù)據(jù)庫獲取 Res作用靶點，用GeneCard數(shù)據(jù)庫獲取疾病相關靶點，用Venny圖獲取Res抗衰老靶點。

在PPI網(wǎng)絡中，靶點互相關聯(lián)節(jié)點數(shù)最高的前5名是IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR。此外，Res抗衰老潛在靶點的蛋白互相作用圖還提示 IGF1、ALB、ESR1、MAPK1、EGFR 與 SIRT1相互聯(lián)系。SIRT1是重要的轉錄調(diào)節(jié)因子，下游眾多因子已被發(fā)現(xiàn)對哺乳動物衰老有明顯的抑制作用[25-26]，一方面參與調(diào)控NF-κB、FOXO、p53等，另一方面參與細胞葡萄糖穩(wěn)態(tài)的保護，有利于延長生物體壽命，防止衰老。在氧化應激誘導的細胞衰老模型中，Res能增加Sirtuins活性，抑制過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）誘導人原代角質形成細胞衰老[27]。

FOXO3可影響細胞凋亡、細胞增殖等生物過程，其受Akt1，MAPK1等因子調(diào)節(jié)，在人類角質形成細胞中表達較高[28]。胰島素的敏感性和細胞內(nèi)信號傳導受 AMPK-FOXO3的調(diào)控。Res通過 FOXO3參與許多細胞的基本過程，包括細胞應激的抵抗、胰島素信號的傳遞和壽命等。敲除FOXO3后，Res不影響細胞衰老和增殖。因此，Res對角質形成細胞衰老和增殖的影響是由AMPK-FOXO3信號途徑調(diào)控的。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學方法對Res對抗衰老的潛在靶點進行分析。在蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡中MAPK1、IGFR和EGFR處于蛋白相互聯(lián)系的核心位置，與其他靶點關聯(lián)度高；GO富集分析和KEGG通路分析提示EGFR、MAPK1和IGFR與信號通路PI3K-Akt、FoxO和HIF-1存在聯(lián)系；在藥物-疾病-靶點- GO-KEGG通路網(wǎng)絡圖中MAPK1、IGFR、EGFR是相關度最好的靶點，說明他們可能是核心靶點。因此，Res主要通過MAPK1、IGFR和EGFR調(diào)節(jié)胰島素、sirtuin和SIRT1等因子，進而影響FoxO、PI3K-Akt和HIF-1信號通路，調(diào)控衰老，這些結果為Res抗衰老的發(fā)病機制提供了新的研究思路。