高頻脈沖電場腎動脈消融可行性探究

張俊民，盧成志，薛志孝，蘇司穎，劉尚忠

高血壓為常見心血管疾病，全球高血壓患者已超過10億人。即便嚴格使用降壓藥物治療，仍有15%～18%的患者會發展為難治性高血壓［1］。血壓控制不良會對高血壓患者的器官（如心臟、大腦和腎臟）造成繼發性損傷，患者預后較差。適當的血壓控制可以顯著降低心血管疾病的發生率。現階段控制血壓的方法除藥物治療以外，還有腎動脈去交感神經術（RDN）［2］。RDN是一種通過離斷腎交感傳出及傳入神經的方式來降低交感神經活性，抑制腎素血管緊張素醛固酮系統激活，進而治療難治性高血壓的新興微創介入技術。脈沖電場消融運用不可逆電穿孔技術（irreversible electroporation，IRE），具有消融迅速、消融區域可控、靶向性強、不損傷其他組織的特點，在腫瘤消融中療效顯著［3］，但結合RDN消融腎動脈交感神經的研究尚少見。本研究以高頻脈沖電場消融腎動脈交感神經為切入點，通過細胞消融實驗及巴馬香豬腎動脈神經消融實驗，探究腎動脈交感神經最佳消融參數范圍，以及IRE結合RDN消融巴馬香豬腎動脈交感神經的有效性及安全性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，大鼠胸大動脈平滑肌細胞A7r5購自中國醫學科學院分子干細胞科學卓越創新中心，均由本實驗室凍存使用。

1.1.2實驗動物 巴馬香豬4只購自天津裕達實驗動物養殖有限公司，分別標注為1號：月齡3個月，30 kg，雌性；2號：月齡5個月，90 kg，雄性；3號：月齡4個月，70 kg，雌性；4號：月齡4個月，67 kg，雄性；均在屏障環境下飼養7～15 d后進行實驗。

1.1.3實驗試劑及儀器 MTT檢測試劑盒、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson染色試劑盒及Warthin-starry銀染色液購自北京索萊寶科技有限公司；鹽酸賽拉嗪注射液（陸眠寧，2 mL：0.2 g；批號：20191001）購自吉林省華牧動物保健品有限公司；咪達唑侖注射液（力月西，1 mL：5 mg；批號：MZ200209）購自江蘇恩華藥業股份有限公司；丙泊酚注射液（1 mL：10 mg；批號：12002373）、二甲基亞砜（DMSO）購自默克醫藥生物科技公司。磷酸鹽緩沖液（PBS）、RPMI 1640液體培養基、酶聯免疫吸附測定儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DMEM高糖培養基購自思拓凡生物科技（杭州）有限公司。第二代脈沖場消融治療儀YLT-PFA01購自天津鷹泰利安康醫療科技有限責任公司；倒置顯微鏡、正置顯微鏡購自日本Olympus公司；Leica SCN400玻片掃描系統購自德國Leica公司。電極杯購自美國BTX公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養 平滑肌細胞A7r5使用含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、89%DMEM培養基培養；神經細胞SH-SY5Y使用含15%FBS、1%青霉素-鏈霉素-兩性霉素B溶液、84%RPMI 1640培養基培養。細胞于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養至對數生長期。

1.2.2IRE脈寬分組 本研究脈寬設置有單脈沖、長脈沖、雙向脈沖（包括對稱及不對稱2種方式）。對稱脈沖的正負脈沖脈寬相同；不對稱脈沖的脈寬用P-Dp-N-Dn表示，P為正脈沖脈寬，Dp為正脈沖延時，N為負脈沖脈寬，Dn為負脈沖延時。2種細胞均設置對照組（不進行電擊）以及實驗組，實驗組根據不同脈沖模式分組：脈寬為5μs的單脈沖組、雙向脈沖5-5-5-5組、雙向脈沖5-3-3-5組、雙向脈沖7-3-3-7組和長脈沖組。

1.2.3細胞消融與殺傷效果檢測 收集對數生長期細胞，調整密度為2×105個/mL，吸取600μL至電極杯，電極杯連接脈沖電場消融儀正負電極并固定，電壓設置100～700 V，間隔200 V，脈沖個數為500，進行IRE消融細胞，見圖1。消融完成后立即分5次，每次將電擊杯中100μL懸濁液移入96孔板，剩余棄去，每組設置2個復孔，設置空白組（僅加入培養液）。培養箱孵育24 h，倒置顯微鏡觀察細胞貼壁。細胞貼滿后每孔加入10μL MTT溶液繼續培養4 h后終止培養，吸去70μL孔內培養液，再加入50μL DMSO溶液，溶解10～15 min后采用酶聯免疫吸附測定儀490 nm處檢測各孔的光密度（OD）值。通過細胞存活率評價殺傷效果。存活率=（a-c）/（b-c）×100%。其中a為實驗組OD值；b為對照組OD值；c為空白組OD值。本研究以存活率達到0為完全消融，存活率未達到0為未完全消融，倒置顯微鏡下觀察消融后A7r5平滑肌細胞和SH-SY5Y神經細胞，比較細胞形態變化。

Fig.1 Shock process of SH-SY5Y cells and A7r5 cells by pulsed electric field ablation instrument圖1 脈沖電場消融儀電擊SH-SY5Y細胞和A7r5細胞過程

1.2.4IRE消融巴馬香豬腎動脈交感神經 每只巴馬香豬分別設置消融參數及部位，見表1。1、2號豬右腎動脈為對照（不電擊），僅做切片染色觀察。根據巴馬香豬體質量，對其實行術前靜脈注射麻醉，術中靜脈滴注保持麻醉以減少抽搐，麻醉藥品及劑量見表2。豬取仰臥位行股動脈穿刺，以股動脈內側0.5 cm與腹股溝皮折線交點為穿刺點，30°～45°角進針，成功后保持穿剌針原位不動，送入導絲，固定導絲退出穿刺針，沿著導絲送入鞘管，引導消融電極進入腎動脈內目標消融點。固定鞘管拔出導絲，肝素鹽水沖管。

Tab.1 Parameter of renal artery sympathetic nerve of Alabama Swine by IRE表1 IRE消融巴馬香豬腎動脈交感神經參數

Tab.2 Narcotic drugs and dosage表2 麻醉藥品及劑量

1.2.5消融腎動脈組織切片染色 消融腎動脈組織經固定、脫水、組織包埋與切片后，采用HE染色、Masson染色及Warthin-starry銀染色，掃描載玻片并進行數字成像掃描觀察。

1.3統計學方法 采用SPSS及origin pro 2019軟件進行統計分析。計量資料以均值±標準差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 消融后細胞觀察 顯微鏡下觀察可見A7r5和SH-SY5Y細胞形態隨電壓的改變發生變化，電壓在100～300 V時，2種細胞多數正常存活，少量凋亡呈圓形。電壓500 V時，A7r5細胞已接近全部凋亡，電壓700 V時，SH-SY5Y細胞接近全部凋亡，見圖2。

2.2 IRE消融A7r5和SH-SY5Y細胞效果 電壓500 V時，A7r5細胞在各脈沖模式下均未完全消融，單脈沖與長脈沖細胞存活率差異無統計學意義，但低于雙向脈沖5-5-5-5（P＜0.05）；雙向脈沖5-5-5-5、5-3-3-5、7-3-3-7細胞存活率依次升高（P＜0.05）；SH-SY5Y細胞在各脈沖模式下均未完全消融，且細胞存活率均顯著高于同類型脈沖下A7r5細胞（P＜0.01），見表3。電壓700 V時，2種細胞在各脈沖模式下均未完全消融，A7r5細胞平均存活率接近5%，雙向脈沖5-3-3-5消融后細胞存活率高于雙向脈沖5-5-5-5（P＜0.05），其余脈沖模式下細胞存活率差異無統計學意義。A7r5細胞在雙向脈沖模式下，細胞存活率低于SH-SY5Y細胞（P＜0.01），在單脈沖和長脈沖模式下差異無統計學意義，見表4。

2.3 巴馬香豬腎動脈消融效果 1、2號豬消融過程中發生輕微抽搐，未影響實驗，3號、4號豬消融過程穩定。3號豬右腎動脈消融組織HE染色可見靜脈血管壁纖維化，動脈局灶外膜、中膜斷裂，管壁纖維化，局部內皮受損，血栓形成，見圖3A；Masson染色可見動脈血管壁呈綠色，纖維化，見圖3B。3號豬左腎動脈消融組織HE染色可見靜脈淤血，管壁纖維化，血管內皮細胞增生，灶性壞死，見圖3C；Masson染色血管平滑肌可見血管壁局部呈綠色，纖維化，局部內膜纖維化，見圖3D。1號豬右腎動脈HE染色可見小動脈管壁纖維化，局部彈力纖維斷裂，形態較完整，圖3E；Masson染色可見血管壁纖維化，形態較完整，見圖3F。4號豬左腎動脈消融后Warthin-starry銀染色交感神經組織呈淺褐色，神經細胞不可見，神經組織遭破壞，見圖3G、H。2號豬800 V消融左腎動脈Warthin-starry銀染色交感神經組織淺褐色，神經細胞不可見，見圖3I。2號豬右腎動脈Warthinstarry銀染色可見大量棕黑色神經細胞，交感神經組織未破壞，見圖3J、K、L。

Fig.2 The morphology of A7r5 cells and SH-SY5Y cells under different voltages observed by confocal microscope(×100)圖2 顯微鏡觀察不同電壓下A7r5細胞及SH-SY5Y細胞形態（×100）

Tab.3 Comparison of survival rates ablated by IRE at 500 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表3 電壓500 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

Tab.3 Comparison of survival rates ablated by IRE at 500 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表3 電壓500 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與單脈沖比較，c與長脈沖比較，d與雙向脈沖5-5-5-5比較，e與雙向脈沖5-3-3-5比較，P＜0.05

組別A7r5 SH-SY5Y t對照組100.00±1.64 100.00±1.99單脈沖3.67±0.41a 51.18±2.94a 50.612＊＊長脈沖4.51±1.27a 22.86±5.32ab 9.492＊＊雙向脈沖5-5-5-5 11.36±1.68abc 87.98±6.12abc 34.125＊＊雙向脈沖5-3-3-5 42.83±0.90abcd 80.99±3.54abcd 29.523＊＊雙向脈沖7-3-3-7 64.33±2.19abcde 76.06±1.98abcd 11.240＊＊F 5 626.540＊＊408.070＊＊

Tab.4 Comparison of survival rates ablated by IRE at 700 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表4 電壓700 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

Tab.4 Comparison of survival rates ablated by IRE at 700 V under various pulse modes between A7r5 cells and SH-SY5Y cells表4 電壓700 V IRE各脈沖模式下消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞存活率比較 （n=8，%，±s）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與單脈沖比較，c與長脈沖比較，d與雙向脈沖5-5-5-5比較，e與雙向脈沖5-3-3-5比較，P＜0.05

組別A7r5 SH-SY5Y t對照組100.00±1.64 100.00±1.99單脈沖5.29±2.41a 4.74±0.88a 0.092長脈沖5.45±1.54a 4.23±0.30a 2.195雙向脈沖5-5-5-5 3.58±2.51a 24.62±5.89abc 9.290＊＊雙向脈沖5-3-3-5 7.54±2.21ad 11.42±0.77abcd 5.758＊＊雙向脈沖7-3-3-7 3.05±1.42a 14.77±3.21abcd 9.447＊＊F 1 973.530＊＊1 566.370＊＊

Fig.3 The renal arterial tissue ablated by IRE圖3 IRE消融腎動脈組織染色

3 討論

在難治性高血壓的病理生理過程中，腎臟交感神經系統起關鍵作用，超過75%的交感神經分布在距血管內膜4.28 mm以內［4-5］，易發生消融不完全的情況。目前去交感神經術大多使用導管射頻消融，同時破壞雙側腎臟的部分傳入和傳出神經，降低整個機體交感系統的活性［6］。射頻消融采取熱效應原理，手術過程中有可能會出現細胞殘余，導致消融失效、高血壓復發，需二次消融的情況［7］。研究表明，IRE是一種通過極短的強力電場使細胞膜產生永久性穿孔的組織消融技術，可通過破壞細胞穩態引導細胞凋亡［3］。IRE不產熱，并具有良好的組織專一性和清晰的消融范圍邊界，現已應用于胰腺癌、前列腺癌等腫瘤消融［8-9］。研究表明，不同細胞在IRE中的消融閾值不同［10］。為探究最佳消融參數范圍，本研究分析了SH-SY5Y和A7r5細胞在不同消融參數下的存活率，通過調整脈沖類型和電壓參數，篩選出對腎動脈血管損傷小且對神經組織殺傷效果較好的參數組。顯微鏡下觀察A7r5細胞及SH-SY5Y細胞發現，凋亡細胞數量隨電壓升高而增加，與對照組相比，不同脈沖類型IRE在不同電壓下均對A7r5細胞及SH-SY5Y細胞有殺傷效果，且電壓達到特定閾值后，細胞平均存活率可降至15%以下水平，表明高頻脈沖電場可以消融A7r5細胞及SH-SY5Y細胞。電壓500 V時，A7r5細胞存活率平均水平除雙向脈沖7-3-3-7模式以外，均降至50%以下，SH-SY5Y細胞存活率在2種不對稱脈沖中無明顯差異，而單脈沖、長脈沖的殺傷力明顯強于雙向不對稱脈沖。電壓700 V時，A7r5細胞存活率平均水平在5%左右，接近完全消融，除在雙向脈沖5-3-3-5細胞存活率較高以外，余各脈沖模式下無明顯差異；SH-SY5Y細胞除在雙向脈沖5-5-5-5細胞存活率較高以外，余模式下存活率平均水平均降至15%以下。A7r5細胞和SH-SY5Y細胞在單脈沖和長脈沖模式下存活率無明顯差異，細胞殺傷力最強。此外，除在700 V時單脈沖和長脈沖以外，余參數下SH-SY5Y細胞存活率均顯著高于A7r5細胞，可見SH-SY5Y細胞在消融過程中耐電性強于A7r5細胞，雙向脈沖5-3-3-5對A7r5細胞損傷較小，且對SH-SY5Y細胞的消融效果較好。

脈沖電場對肌肉神經直接刺激，可造成強勁的肌肉收縮，能量越高，刺激越強，消融時需使用肌松劑配合，以減少消融過程中的肌肉收縮，防止造成抽搐［11］。在腹部腫瘤行IRE術時，單脈沖及長脈沖可造成不同程度肌肉收縮，導致電極針位移，不僅影響消融效果，電極針也會引起痛感、損傷器官［12］。減少肌肉收縮需大量使用肌肉松弛劑，而大量使用肌松劑有造成橫紋肌溶解的風險［13］。為避免上述情況，有研究發現使用高頻雙向5-5-5-5脈沖配合肌松劑可以消融前列腺癌，且相比單脈沖和長脈沖能緩解肌肉收縮，提高安全性［14］。本研究所有脈沖類型均可以消融豬腎動脈交感神經，消融效果得到保證，在使用肌松劑的情況下，雙向脈沖5-5-5-5模式仍造成豬輕微抽搐，但雙向不對稱5-3-3-5脈沖和雙向不對稱7-3-3-7消融過程更為平穩。電壓700 V時，2種細胞分別在雙向脈沖5-3-3-5和雙向脈沖7-3-3-7的存活率無明顯差異，消融效果一致，但雙向5-3-3-5脈寬能量更低，造成肌肉收縮風險更低，因此雙向不對稱脈沖5-3-3-5為消融最優參數組。

綜上所述，高頻脈沖電場對腎動脈神經組織有明顯殺傷力，可有效消融豬腎動脈交感神經，且雙向不對稱脈沖5-3-3-5可提高手術的安全性。