單眼剝奪性弱視小鼠圖形視覺誘發電位時間頻率調制變化的研究

馬博文，呂文超，王玨，張偉，史學鋒

在視覺發育早期，由于異常視覺經驗引起的視覺神經系統發育異常可導致弱視［1-2］。弱視在兒童中的患病率為2%～3%［3］。傳統觀點認為，弱視是以空間分辨力（視銳度）下降、對比敏感度降低和整體加工能力降低等為特點的空間信息處理能力缺陷為主的疾病［4］。然而，近年有研究表明，在弱視患者中，視覺相關的時間信息處理能力也會發生改變［5-6］。諸多與時間頻率有關的指標，如臨界融合頻率、時間對比敏感度［7］、時空對比敏感度、時間超銳度等均會出現一定程度的損害。有關弱視猴的研究顯示，與正常眼相比，弱視眼在高時間頻率時的時間對比敏感度差異大于低時間頻率時的差異［8］。因此，深入研究弱視的時間信息處理能力缺陷及其機制有重要的臨床意義。視覺誘發電位（visual evoked potential，VEP）是從視皮層腦電活動中提取的視覺刺激誘發的電生理信號，是評估弱視視覺功能的一種重要的客觀檢查方法。本研究采用基于腦表面埋置電極記錄［9］的方法觀察單眼剝奪性弱視小鼠圖形視覺誘發電位（pattern visual evoked potential，PVEP）的時間頻率調制的變化，為深入探討弱視的時間信息加工功能損害機制建立基礎。

1 材料與方法

1.1材料 C57BL/6J雄性SPF級小鼠18只，生后26 d，體質量12～15 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，屈光間質透明無病變。將小鼠按照隨機數字表法分為對照組和單眼剝奪（monocular deprivation，MD）組，每組9只。動物飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所實驗動物中心，飼養環境通風良好，溫度18～26℃，采用12 h/12 h光照/黑夜環境交替飼養，飼養條件符合醫學實驗動物飼養要求（倫理審查編號：IRM-DWLL-2020159）。

1.2研究方法

1.2.1單眼剝奪性弱視模型的建立 小鼠于麻醉條件下，剪去右眼的上下瞼緣，采用10/0尼龍線將上下瞼緣對齊縫合，在切口處涂典必殊眼膏預防感染。術后每天檢查切口愈合情況，5 d后拆除縫合線，打開已閉合的眼瞼，并在顯微鏡下觀察屈光間質的透明度。如遇造模中途眼瞼開裂，或造模完成后發現屈光間質混濁等異常情況，則不予入組并以新鼠替補，重新造模。見圖1。

1.2.2電極埋置 采用腦表面電極埋置技術［9］。小鼠行5%水合氯醛（10μL/g）麻醉后，將其固定在立體定位儀上。使用體溫維持儀保持其體溫在36.5℃。雙眼涂眼膏或硅油以防止其角膜干燥。碘附消毒后，剪去小鼠顱骨表面的皮毛，于記錄眼對側視皮層雙眼區（后囟旁3 mm），以1.5 mm為直徑開一個微小顱窗，保留硬腦膜，并將自制金屬電極放置在視皮層表面硬腦膜上，將透明玻璃片蓋于其上，并用生物膠固定，即完成記錄電極的埋置。于記錄眼同側額骨上，用相同方法埋置參考電極。最后使用牙科水泥覆蓋暴露的顱骨。待小鼠在體溫維持儀上蘇醒后，再將其放回籠中。

Fig.1 Monocularly deprived mouse model圖1 單眼剝奪性弱視小鼠模型

1.2.3數據采集 于電極埋置術后第1天，將小鼠麻醉后，待其尾部夾捏反應消失，將其置于視覺刺激器屏幕正前方15 cm處。將記錄電極和參考電極與前置放大器的電極接頭相連。記錄過程中若小鼠出現夾捏反應，則追加少量麻醉藥。測試過程中使用的視覺刺激采用自編的Matlab程序控制。采用垂直光柵圖形刺激，光柵空間頻率一致，均為0.02周/度，疊加次數240次，屏幕亮度20坎德拉/平方米（cd/m2），對比度為80%。按照事先設計的偽隨機序列給予小鼠6種不同時間頻率的視覺刺激。6種時間頻率分別為2.50、1.25、1.00、0.75、0.50和0.25 Hz。相鄰2次刺激間在空間相位上以180°翻轉，后一次刺激發生的時間間隔為偽隨機序列確定的相應時間頻率的倒數。所有數據采集過程均在暗環境中進行。記錄到的視覺誘發電位信號通過CED1401數據采集系統（英國Cambridge Electronic Design公司）采集并通過Spike2軟件（英國Cambridge Electronic Design公司）保存在電腦中。將采集到的數據導入Matlab軟件，用自編的程序對數據進行疊加平均處理，分析不同刺激條件下得到的PVEP P100波振幅。

1.3統計學方法 采用GraphPad Prism 9.1.1統計軟件（美國GraphPad Software公司）進行數據分析。數據均進行正態分布檢驗，采用±s形式表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey法。2組間相同時間頻率條件下PVEP測量結果的比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MD小鼠PVEP反應的時間頻率調制特性的改變 對照組小鼠對所有6種時間頻率的PVEP P100波反應幅值差異無統計學意義（F=2.214，P＞0.05），見圖2。MD組小鼠對6種時間頻率的PVEP P100波反應幅值差異有統計學意義（F=6.588，P＜0.01），其時間頻率調制曲線表現為低通特性，在高時間頻率刺激條件下的反應顯著低于低時間頻率刺激條件下反應，見圖3。

Fig.2 Temporal frequency tuning curve of PVEP responses in the Ctrl group圖2 對照組小鼠PVEP反應的時間頻率調制曲線

Fig.3 Temporal frequency tuning curve of PVEP responses in the MD group圖3 MD組小鼠PVEP反應的時間頻率調制曲線

2.2 不同時間頻率刺激條件下2組小鼠PVEP反應幅值的比較 高時間頻率（2.50和1.25 Hz）視覺刺激條件下，與對照組（145.7μV±63.8μV，155.7μV±54.2μV）相比，MD組（85.7μV±41.6μV，94.8μV±52.3μV）P100波幅值顯著降低（t分別為2.362和2.425，P＜0.05）。在中低時間頻率（1.00 Hz、0.75 Hz、0.50 Hz、0.25 Hz）刺激條件下，2組間P100波反應幅值差異無統計學意義（t分別為1.347、0.583、1.155和0.054，均P＞0.05）。

3 討論

弱視是指在兒童視覺發育早期由于單眼斜視、未矯正的屈光參差、高度屈光不正及形覺剝奪等異常視覺經驗而導致的單眼或雙眼視力受損的一種神經發育異常性疾病［10-11］。弱視引起的視覺損傷可伴隨終身且較明顯，是一個重要的公共健康問題，其中單眼形覺剝奪性弱視較雙眼弱視后果更為嚴重。在視覺發育關鍵期，視覺神經系統的發育非常迅速，這一時期各種異常視覺經驗即使是短暫的作用都極易干擾和破壞神經系統的正常發育，導致視力、立體視功能、眼球運動功能等發育的異常［12］。在視覺神經系統中，視覺刺激引起視皮層神經元群體產生的信號必須進行整合以形成視覺感知［13］。正常的視覺信息的整合既包括空間信息的整合，也包括時間信息的整合。既往研究發現，大鼠外側膝狀體神經元的時間頻率調諧特性隨著發育逐漸成熟，其最優時間頻率至成年時達到最高值［14］。有研究推測，弱視患者之所以對高時間頻率視覺刺激的敏感性下降，可能原因是視覺系統對視覺信息的傳遞和整合存在缺陷［15］。功能性磁共振研究也發現，弱視患者對視覺信息的處理能力受損［16］，并且可能存在相關視皮層區域的神經解剖學損害［17］。Yang等［6］通過心理物理學研究認為，弱視患者存在時間頻率甄別缺陷。然而，目前尚鮮見有關弱視的時間信息整合能力缺陷的神經回路和細胞分子機制及干預策略的深入研究，迫切需要在整體動物水平建立可客觀評估的模型。PVEP是一種客觀評估整體視功能的技術手段。小鼠是廣泛應用于眼科與視覺科學研究的模式動物，其飼養簡單、成本較低，且有大量以C57品系為背景的轉基因小鼠可供深入開展相關機制的研究。然而，由于小鼠的PVEP記錄難度較高，以小鼠為模型動物開展的有關弱視時間信息整合能力缺陷的研究鮮見報道。本研究采用基于腦表面埋置電極記錄［9］的方法探討了MD小鼠PVEP的時間頻率調制的變化，揭示了MD組小鼠的時間頻率調制曲線表現為低通特性，其在高時間頻率刺激條件下的反應顯著低于中低時間頻率刺激條件。與對照組相比，高時間頻率視覺刺激條件下，MD組反應顯著降低，而在中低時間頻率刺激條件下，MD組視覺反應的損害未受到明顯影響。筆者推測MD小鼠視皮層神經元對于高時間頻率的視覺信息的加工整合和分析能力降低，造成視覺神經元的反應受到抑制。

另外，在本研究中，對照組小鼠對6種時間頻率的PVEP P100波反應幅值無顯著差異，其時間頻率調制曲線基本表現為全通特性，但是在1.25 Hz和0.50 Hz處存在幅度較小的2個峰。既往研究發現，采用掃描VEP可記錄到雙峰現象［18-19］。這種雙峰是視覺信息在2個平行通道，即瞬態通道和持續通道交互作用的結果，2個通道具有不同的空間和時間處理能力。已知在視覺系統中存在2條主要的攜帶視覺信息的傳導通路，即大細胞通路和小細胞通路。大細胞通路主要攜帶高時間頻率和低空間頻率的視覺信息，小細胞通路主要攜帶高空間頻率和低時間頻率的視覺信息［20］。2種細胞通路將視覺信息從視網膜傳輸到視皮層。本研究發現，MD組時間頻率調制曲線既未出現雙峰，也未在低空間頻率段出現單峰，且在高時間頻率段PVEP反應較對照組明顯降低，提示在MD組小鼠兩條通路的時間信息加工能力均存在損害，但以大細胞通路的時間信息加工功能受損更為明顯。