m6A修飾調控的COL6A5對肺腺癌細胞侵襲能力的影響

王馨，黃嘉星，潘輝林，馮正富，湯銳明，邱惠思

據美國癌癥學會統計，2020年全球新診斷肺癌220.02萬例，因肺癌死亡的患者有180萬例［1］。根據組織類型可將肺癌分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占所有肺癌病例的85%，其組織學亞型主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細胞癌［2］。據美國癌癥學會統計，肺癌死亡患者中約40%為肺腺癌［3］。目前，肺腺癌的發病機制尚未明確。6型膠原蛋白α5（COL6A5）含有336個氨基酸組成的三重螺旋結構，側翼則包括7個N末端von Willebrand因子A樣結構域和3個C末端von Willebrand因子A樣結構域［4］。有研究報道，COL6A5的3個單核苷酸多態性（SNP）位點rs13062453、rs1497305和rs77123808與肺癌風險顯著相關［5］，但目前關于COL6A5在肺腺癌中作用的研究尚少見。本研究擬從數據庫、組織標本和細胞層面分析COL6A5在肺腺癌中的表達模式，探討其在肺腺癌發生發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺腺癌細胞（A549、H1975、H1650、PC9和H1299）均購自中科院上海細胞所。胎牛血清和1640培養基均購自Gibco公司。Lipofectamine 3000轉染試劑、逆轉錄試劑盒、PowerUp?SYBR?Green預混液和COL6A5抗體均購自Fermentas公司。RNA extraction kit購自廣州飛揚生物有限公司。鋅指轉錄因子（ZEB1）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、鋅指轉錄因子家族蛋白（Snail）、Twist相關蛋白1（Twist1）、AlkB家族同源蛋白5（ALKBH5）和β-肌動蛋白（β-actin）抗體均購自Cell Signaling Technology。Magna RIP?RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購自Millipore公司。ALKBH5 shRNA質粒和COL6A5過表達質粒均購自廣州復能生物有限公司。CO2培養箱購自美國ThermoFisher有限公司，熒光定量PCR儀、蛋白電泳儀及濕轉系統均購自美國BioRad公司，倒置相差顯微鏡購自美國Leica公司。

1.2標本收集 收集2013年3月—2018年12月于廣州醫科大學附屬第六醫院胸外科就診的肺腺癌患者27例，其中男16例，女11例，年齡27～91歲，平均（47.90±3.02）歲。所有患者均經病理學確診為肺腺癌，收集患者肺癌組織及配對的癌旁正常組織，于-196℃液氮中保存備用。本研究經我院倫理委員會批準，并與患者簽署知情同意書。

1.3轉染 將H1299細胞用含10%胎牛血清的1640培養基于37℃5%CO2培養箱中培養。待其融合度為80%時，將該細胞以4×104個/孔接種至6孔板，置于37℃5%CO2的培養箱中過夜，次日進行脂質體轉染。利用Lipofectamine 3000轉染試劑進行脂質體轉染。組分1配制：3μg質粒（COL6A5過表達質粒、靶向ALKBH5的各個shRNAs以及各對照質粒）和5μL p3000與500μL無血清培養基混合均勻；組分2配制：5μL Lipofectamine 3000加入500μL無血清培養基混合均勻。將組分1和組分2混合，室溫靜置30 min，將上述混合液加入6孔板中，48 h后用于后續研究。在轉染時，將過表達COL6A5分為con組（轉染對照質粒con）和過表達組（轉染COL6A5）。敲低ALKBH5分為4組：con組（轉染對照質粒con）、sh-1#組（轉染靶向ALKBH5的shRNA片段1質粒）、sh-2#組（轉染靶向ALKBH5的shRNA片段2質粒）和sh-3#組（轉染靶向ALKBH5的shRNA片段3質粒）。

1.4實時熒光定量PCR（qPCR）檢測mRNA表達 按照RNA提取和cDNA合成試劑盒的說明書操作，分別提取目標細胞（H1299、H1975、A549、BEAS-2B、H1650和PC9）和目標組織（肺腺癌組織及配對癌旁組織）RNA并逆轉錄成cDNA。SYBR法用于檢測mRNA表達，各基因引物序列見表1。PCR反應體系：SYBR Mix 10μL，上、下游引物各0.5μL，模板1μL，雙蒸水8μL。反應條件：25℃2 min，95℃預變性2 min；95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量，實驗重復3次。

Tab.1 Primer lists in this study表1 qPCR引物序列

1.5Western blot法檢測蛋白的表達量 將目標細胞H1299、H1975、A549、BEAS-2B、H1650和PC9以7×104個/孔接種于6孔板，于37℃5%CO2培養箱中培養過夜。次日，棄去培養基，預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞1次，每孔加入60μL含有cocktail蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰浴10 min。將細胞收集至離心管中，14 000×g高速離心10 min，取上清液即為細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品上樣量20μg，蛋白樣品經10%SDS-PAGE電泳（100 V恒壓）分離后，200 mA恒流1.5 h轉至PVDF膜上。PVDF膜經5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗（COL6A5抗體1∶800；E-cadherin抗體1∶1 000；ZEB1抗體1∶1 000；Snail1抗體1∶600；Twist1抗體1∶1 000；ALKBH5抗體1∶500；β-actin抗體1∶5 000）孵育過夜。TBST洗滌3次，每次5 min。分別加入羊抗兔二抗或者羊抗鼠二抗（1∶10 000）室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。ECL底物發光試劑盒增強發光，X線膠片顯影。蛋白條帶用Image J進行灰度分析。實驗重復3次。

1.6Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力 將1×105個細胞用1%胎牛血清的1640培養基重懸，加入Transwell上室，下室中加入600μL完全培養基；培養24 h后，將小室置于甲醇中固定20 min，棄去小室里面的培養基，用棉簽輕輕擦掉小室里面的細胞及基質膠，將小室置于1%結晶紫中染色10 min，流動水沖掉結晶紫，風干；在顯微鏡下隨機讀取5個視野，拍照并計數侵襲過小室的細胞。侵襲能力抑制率=（對照組侵襲細胞數-實驗組侵襲細胞數）/對照組侵襲細胞數×100%，實驗重復3次。

1.7RNA甲基化免疫沉淀-實時熒光定量PCR（MeRIPqPCR）實驗檢測轉錄本上是否存在m6A位點 按照Magna RIP?RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit說明書進行MeRIP-qPCR實驗。將1×106個H1299細胞接種至直徑10 cm細胞培養皿中，用700μL RIP裂解液冰上裂解細胞10 min，14 000×g離心10 min，取上清液作為細胞裂解物，用wash buffer重懸磁珠，分為IgG組（加入Normal Rabbit IgG抗體）和m6A組（加入anti-m6A抗體），室溫孵育1 h。將上述磁珠/抗體混合物與細胞裂解液4℃孵育過夜，wash buffer洗滌3次，蛋白酶K處理上述磁珠沉淀，純化RNA并逆轉錄成cDNA，按照1.4中的方法檢測COL6A5mRNA的表達。

1.8生物信息學預測

1.8.1Oncomine Oncomine（https：//www.oncomine.org/resource/login.html）查詢條件為：“Gene：COL6A5”，“Analysis Type：Cancervs.Normal”，“Cancer Type：Lung Cancer”，“Data Type：mRNA”。探究COL6A5在肺癌中的表達情況。

1.8.2GEPIA GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）查詢條件為：選 擇“Boxplots”，“gene：COL6A5”，“Datasets Selection：LUAD，點擊add”，點擊“Plot”，即可查詢COL6A5與肺腺癌患者預后的關系。

1.8.3cBioPortal for Cancer Genomics cBioPortal for Cancer Genomics數據庫（https：//www.cbioportal.org/）用于查詢與COL6A5表達相關的基因。打開數據庫，“Select Studies for visualization&Analysis：Lung，LUNG ADENOCARCINOMA”，選擇“lung adenocarcinoma（TCGA，PanCancer Altas）”，點擊“Query by Gene：mRNA expression；Entre Genes：COL6A5”，點擊“submit Query”，點擊“Co-expression”，即可查看與COL6A5表達相關的基因。

1.8.4SRAMP 進入SRAMP網站（http：//www.cuilab.cn/sramp），點擊“Prediction”，輸入COL6A5 mRNA序列，點擊“submit”，即可查詢COL6A5轉錄本上潛在的m6A位點。

1.9統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行數據處理。計量資料以±s表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析；相關分析采用Pearson相關。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 COL6A5在肺腺癌中的表達模式 在線數據庫Oncomine分析結果顯示，與正常組織相比，COL6A5在肺癌組織中顯著低表達，見圖1。GEPIA數據庫分析結果顯示，肺腺癌組織中COL6A5mRNA表達水平（n=483，0.77±0.09）顯著低于正常組織（n=347，2.61±0.22），差異有統計學意義（t=4.710，P＜0.05）。本研究qPCR結果亦顯示，肺腺癌組織中COL6A5mRNA表達水平低于癌旁正常組織（0.97±0.01vs.1.66±0.04，n=27，t=2.220，P＜0.05）。COL6A5mRNA在正常肺上皮細胞BEAS-2B及肺腺癌細胞A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達量分別為1.00±0.00、0.14±0.01、0.11±0.00、0.11±0.01、0.13±0.02和0.28±0.06，COL6A5mRNA在A549、H1299、H1975、H1650和PC9中的表達量顯著低于BEAS-2B（n=3，F=192.197，P＜0.01）。

Fig.1 The online databank Oncomine used to measure COL6A5 expression pattern in several kinds of cancers圖1 在線數據庫Oncomine分析COL6A5在多種腫瘤中的表達模式分布圖

Fig.2 The correlation between COL6A5 and prognosis of LUAD patients analyzed by TCGA databank圖2 TCGA數據庫分析COL6A5與肺腺癌患者預后的關系

2.2 COL6A5在肺腺癌中的表達 TCGA數據庫顯示，237例肺腺癌患者隨訪0.92～604.00個月，中位隨訪時間為55.83個月。以COL6A5中位表達量為界，將肺腺癌患者分為高表達組119例（≥333.578）和低表達組118例（＜333.578），高表達組肺腺癌患者累積總生存率高于低表達組（Log-rankP=0.013），見圖2。

2.3 ALKBH5下調COL6A5的表達 在線軟件SRAMP預測結果顯示，COL6A5轉錄本上存在多個m6A位點（圖3A）。本研究MeRIP-qPCR實驗結果顯示，m6A組H1299細胞COL6A5mRNA的相對表達量顯著高于IgG組（39.03±8.63vs.1.00±0.00，t=7.625，P＜0.01）。qPCR結果顯示，肺腺癌組織中ALKBH5mRNA表達水平高于癌旁正常組織（3.99±1.33vs.1.66±0.29，t=3.459，P＜0.01）；肺腺癌組織中ALKBH5mRNA與COL6A5mRNA表達呈負相關（r=-0.599，P＜0.01）。在H1299細胞中敲低ALKBH5，qPCR結果顯示，con組、sh-1#組、sh-2#組和sh-3#組ALKBH5mRNA表達水平分別為1.00±0.00、0.93±0.06、0.22±0.01和0.82±0.07，sh-2#組ALKBH5mRNA表達水平最低（F=152.400，P＜0.01）；Western blot結果顯示，con組、sh-1#組、sh-2#組和sh-3#組ALKBH5蛋白條帶灰度值分別為0.334±0.030、0.862±0.005、0.092±0.003和0.434±0.017，sh-2#組對ALKBH5的沉默率達72.46%（圖3B）。在H1299細胞中敲低ALKBH5，qPCR結果顯示，sh-2#組COL6A5mRNA表達水平明顯高于con組（10.43±2.06vs.1.00±0.00，t=7.940，P＜0.01）；Western blot結果顯示，sh-2#組COL6A5蛋白表達水平高于con組（3.592±0.197vs.0.169±0.001，t=30.100，P＜0.01），見圖3C。

2.4 COL6A5抑制肺腺癌細胞增殖 通過cBioPortal在線數據庫下載與COL6A5共表達的基因，KEGG分析發現COL6A5可能參與上皮間質轉換（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、止 血（hemostasis）和細胞表面相互作用（cell surface interaction）等生命活動，見圖4A。在H1299細胞中過表達COL6A5，Transwell結果顯示，COL6A5過表達組發生侵襲轉移的細胞數目少于con組（275±24vs.581±37，t=9.629，P＜0.01），見圖4B。COL6A5過表達組E-cadherin mRNA和蛋白表達水平升高，ZEB1、Snail1和Twist1 mRNA和蛋白表達水平降低，見圖4C、表2。

Fig.3 The effect of ALKBH5 on COL6A5 analyzed by bioinformatics combined with experiments圖3 生物信息學分析結合實驗驗證ALKBH5對COL6A5的調控作用

3 討論

挖掘數據庫信息對探索肺腺癌發生發展分子機制的研究具有重要作用［6-8］。有研究通過GEO和TCGA數據庫確定了分泌型磷酸化蛋白1（SPP1）在肺腺癌中高表達，且其表達量與肺腺癌患者預后差呈正相關（P=0.017）［9］。在TCGA數據庫中發現8個B7家族配體和CD28家族受體（B7-CD28家族基因）與肺腺癌患者預后有關［10］。從TCGA數據庫中分析到聚合酶ε（POLE）突變能夠提高肺腺癌患者的總體生存率［11］。但是，與程序性細胞死亡配體1（PD-L1）低表達的POLE突變患者相比，PD-L1高表達的POLE突變肺腺癌患者總體生存率較高［11］。有研究者從在線數據庫The Human Protein Altas中提取了基因數據集，通過一系列生物信息學分析發現，有絲分裂紡錘體相關標志物驅動蛋白成員15（KIF15）、有絲分裂檢查點絲氨酸/蘇氨酸激酶（BUB1）、細胞周期蛋白B2（CCNB2）、細胞周期依賴性激酶1（CDK1）、驅動蛋白成員4A（KIF4A）、Discs大同源物關聯蛋白5（DLGAP5）、上皮細胞轉化序列2癌基因（ECT2）和苯胺素（ANLN）可以作為預測肺腺癌患者預后的獨立指標［12］。研究人員從在線數據庫Oncomine以及后期實驗驗證發現，序列相似性為83%的家族成員A（FAM83A）在肺腺癌中顯著高表達，且FAM83A高表達與肺腺癌淋巴結轉移、臨床分期及患者預后有關［13］。本研究通過Oncomine和GEPIA數據庫分析發現，COL6A5基因在肺腺癌中低表達；經qPCR驗證，COL6A5在肺腺癌組織及細胞中的表達量均遠低于癌旁正常組織及正常肺上皮細胞。

Fig.4 Focusing the effect of COL6A5 on the invasion ability of LUAD cells圖4 COL6A5對肺腺癌細胞侵襲能力的影響

Tab.2 Comparison of the expression of EMT biomarkers between the two groups表2 COL6A5過表達組與對照組EMT標志物的表達比較 （±s）

Tab.2 Comparison of the expression of EMT biomarkers between the two groups表2 COL6A5過表達組與對照組EMT標志物的表達比較 （±s）

＊P＜0.05

組別對照組COL6A5過表達組t n 3 3 E-cadherin mRNA 1.00±0.00 7.39±1.63 7.423＊蛋白0.132±0.001 1.923±0.218 19.310＊ZEB1 mRNA 1.00±0.00 0.18±0.09 16.820＊蛋白1.097±0.014 0.634±0.005 53.080＊Snail1 mRNA 1.00±0.00 0.20±0.12 12.710＊蛋白0.314±0.008 0.016±0.002 6.190＊Twist1 mRNA 1.00±0.00 0.39±0.03 39.950＊蛋白1.532±0.182 0.849±0.127 49.890＊

目前，關于COL6A5在腫瘤中的研究較少，且主要集中在突變功能上。有研究報道，在遺傳性大腸癌中COL6A5可發生突變，但是否與大腸癌發生有關及其如何在大腸癌中發揮功能尚未明確［14］。有研究者統計TCGA數據后發現，COL6A5在食管鱗狀細胞癌中低表達，且COL6A5低表達與患者預后不良有關［15］；也有學者統計了GSE84846數據集，發現COL6A5與口腔鱗狀細胞癌患者預后有關［16］；但是上述2個研究僅從不同數據庫分析信息，未行實驗驗證。本研究通過生物信息學預測到COL6A5可能參與調控肺腺癌細胞的EMT表型、止血和細胞表面相互作用等生命活動，并通過Transwell實驗證實COL6A5能夠抑制H1299細胞發生侵襲；qPCR和Western blot結果發現，過表達COL6A5可明顯抑制EMT標志物，增加上皮標志物E-cadherin的表達，提示COL6A5通過調控H1299細胞的EMT表型來抑制其侵襲能力。

近年來，廣泛存在于真核細胞的RNA甲基化（m6A修飾）調控備受關注。m6A修飾能夠影響mRNA的穩定性，進而調節基因的表達，最終參與細胞分化、細胞穩態、細胞對應激的反應等生命活動。在這種修飾系統中，m6A編碼器由核心催化成分甲基 轉 移 酶 樣3（METTL3）/甲 基 轉 移 酶 樣14（METTL14）組成，以插入m6A修飾［17］。ALKBH5和脂肪與肥胖相關蛋白（FTO）被稱為m6A銷碼器，可去除基因轉錄本上的m6A修飾［18］。m6A位點由m6A讀碼器（含YTH結構域的蛋白質和IGF2BPs）執行［19］。本研究通過生物信息學及實驗證實，COL6A5轉錄本上存在m6A修飾位點，且ALKBH5調控COL6A5表達，但是該系統中的讀碼器尚未明確，這將是本課題組下一步研究的內容。另外，COL6A5如何調控細胞EMT相關標志物，進而影響細胞侵襲轉移能力，尚有待進一步研究。在后續研究中，本課題組將通過免疫共沉淀聯合蛋白質譜實驗尋找COL6A5的作用靶標，以揭示其抑制肺癌細胞侵襲轉移的具體分子機制。