DNMT1通過下調SOX1表達參與宮頸癌生長和轉移的機制研究

智艷芳，張婷，劉慧，曾憲旭，班振英，張威

宮頸癌（cervical carcinoma，CC）是女性因惡性腫瘤死亡的主要原因之一，其發生與人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染密切相關，然而僅HPV感染并不足以引起CC［1］，因此CC發生發展的有關分子機制仍有待確定。表觀遺傳學修飾在腫瘤中的作用逐漸被重視，其中DNA甲基化在包括CC在內的多種腫瘤的發展中起著重要作用［2-3］。位于腫瘤抑制基因啟動子區域的CpG島高甲基化在腫瘤發生發展中具有重要作用，可通過調節基因表達影響腫瘤生長或轉移［4］。CpG島甲基化需要DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化，主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b［5］。研究顯示，DNMT1在宮頸癌變過程中的表達強度逐漸增加，且其高表達與患者存活率密切相關［6-7］。性別決定區Y-框1（sex determining region Y-box 1，SOX1）為腫瘤抑制基因，在CC中SOX1呈現高甲基化和低表達狀態［8-9］。但是，DNMT1是否通過SOX1調節CC發展進程尚未知。本研究旨在觀察DNMT1在CC生長和轉移中的作用并分析其對SOX1的調節作用，以期為CC的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級7周齡BALB/c Nude雄性裸小鼠18只，體質量18～20 g，購自北京維通利華公司。CC組織及癌旁組織均來自鄭州大學第三附屬醫院病理科，患者組織離體后，迅速置于液氮中冷凍，然后放入-80℃冰箱中保存待用（患者已簽署知情同意書）。HeLa229、ME-180、SiHa、SW756宮頸癌細胞和Ect1/E6E7宮頸上皮細胞均購自美國ATCC細胞資源中心。EMEM培養基購自南京維森特生物技術有限公司；McCoy′s 5a培養基、Leibovitz L-15培養基、Keratinocyte-SFM培養基均購自南京信帆生物技術有限公司。DNA提取試劑盒、EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒、EpiTect MethyLight PCR試劑盒購自Qiagen公司，LipofectamineTM3000試劑盒及引物購自Invitrogen公司；DNMT1-siRNA質粒及空質粒由上海吉瑪公司構建；DNMT1、Cyclin D1、β-catenin兔單抗購自CST公司；山羊抗兔IgG（HRP）、c-Myc兔單抗、β-actin兔單抗、SOX1兔單抗、Histone H3兔多抗均購自Abcam公司；電泳儀、多功能酶標儀購自BioRad公司；Rotor-Gene Q PCR儀購自Qiagen公司；顯微鏡購自Olympus公司。

1.2細胞培養及分組 HeLa229、SiHa細胞采用EMEM培養基［含10%胎牛血清（FBS）］，ME-180細胞采用McCoy′s 5a培養基（含10%FBS），SW756細胞采用Leibovitz L-15培養基（含10%FBS），Ect1/E6E7細胞采用Keratinocyte-SFM培養基［含0.1μg/L人重組表皮生長因子（EGF）和10%FBS］，置于5%CO2培養箱中（37℃）培養，收集對數期以上宮頸細胞，設置為HeLa229組、ME-180組、SiHa組、SW756組和Ect1/E6E7組。HeLa229、SW756細胞DNMT1蛋白表達水平較高，收集對數生長期HeLa229、SW756細胞，采用LipofectamineTM3000脂質體將空質粒和DNMT1-siRNA質粒轉染入細胞，另設不轉染細胞的對照組，即DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組。

1.3Western blot檢測DNMT1、SOX1蛋白表達 通過蛋白裂解液裂解CC組織、癌旁組織及各組細胞并提取總蛋白，BCA法測定所提蛋白的濃度。分別取40μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后濕法轉印至PVDF膜，經奶粉封閉后與一抗DNMT1（1∶1 000）、Cyclin D1（1∶500）、β-catenin（1∶1 000）、c-Myc（1∶500）、β-actin（1∶5 000）、SOX1（1∶1 000）、Histone H3（1∶2 000）4℃過夜孵育，經TBST洗膜后與二抗羊抗兔IgG（HRP，1∶5 000）室溫孵育35 min，ECL法曝光拍照并分析各檢測蛋白條帶的灰度值。

1.4亞硫酸氫鹽定量PCR測定SOX1甲基化水平 通過DNA提取試劑盒提取CC組織、癌旁組織及各組細胞的基因組DNA，并使用EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒對其進行修飾，將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶。以修飾后的基因組DNA為模板，使用EpiTect MethyLight PCR試劑盒進行熒光定量PCR擴增反應，甲基化比例=［甲基化DNA的拷貝數/（甲基化+未甲基化DNA的拷貝數）］×100%。SOX1甲基化引物上游5′-GCGTTTTTTTTTTTTCGTTATTGGC-3′，下 游5′-CGC?GCTATCTCCTTCCTCCTACG-3′，產物大小154 bp；SOX1未甲基化引物上游5′-TGTGTTTTTTTTTTTTTGTTATTGG-3′，下游5′-TACACACTATCTCCTTCCTCCTACACTC-3′，產物大小156 bp。

1.5細胞克隆實驗測定細胞增殖 收集DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組轉染后48 h的細胞，以每孔1×103個的密度接種至6孔板，培養3周后，棄去培養基并固定細胞，用0.5%結晶紫染色后計數可見細胞克隆。

1.6Transwell實驗測定細胞遷移和侵襲 收集DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組轉染后48 h的細胞，以每孔含5×104個的密度接種至小室上層，小室下層添加500μL EMEM培養基，培養24 h后，用棉簽擦去小室上層的細胞，固定后用0.5%結晶紫染色并拍照，計數穿過小室上層的細胞。侵襲實驗除先在上層小室添加100μL基質膠凝固外，其余均參考遷移實驗進行。

1.7裸鼠成瘤實驗測定細胞在體內的生長 取DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組轉染后48 h的HeLa229和SW756細胞，經胰蛋白酶消化分離后，計數細胞數量并制備1.0×107個/mL的細胞懸液。將上述各組細胞注射進裸小鼠的腋窩外側皮下，裸小鼠分為DNMT1-NC組、DNMT1-siRNA組和空白組，每組6只。每3 d觀察1次腋窩處腫瘤大小，3周后處死小鼠并取出腫瘤稱質量。

1.8統計學方法 采用GraphPad 8.0對數據進行分析。計量數據以均數±標準差（±s）表示，2組間數據比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CC組織及細胞中DNMT1、SOX1蛋白表達情況 CC組織中DNMT1蛋白表達水平（3.55±0.62）高于癌旁宮頸組織（1.65±0.27），SOX1蛋白表達水平（0.25±0.06）低于癌旁宮頸組織（2.85±0.74），差異有統計學意義（n=20，t分別為12.565、15.662，均P＜0.01），見圖1。宮頸癌HeLa229、ME-180、SiHa、SW756細胞中DNMT1蛋白表達水平分別為2.76±0.32、2.57±0.27、2.46±0.39、2.83±0.45，均高于宮頸上皮Ect1/E6E7細胞（1.13±0.04），差異有統計學意義（n=6，F=27.480，P＜0.01），SOX1蛋白表達水平分別為0.28±0.04、0.37±0.05、0.35±0.07、0.31±0.05，均低于Ect1/E6E7細胞（2.08±0.19），差異有統計學意義（n=6，F=387.901，P＜0.01），見圖2。選擇DNMT1蛋白表達水平較高的HeLa229、SW756細胞進行后續實驗。

Fig.1 DNMT1 and SOX1 protein expression in CC tissues圖1 CC組織中DNMT1、SOX1蛋白表達情況

Fig.2 DNMT1 and SOX1 protein expression in CC cells圖2 CC細胞中DNMT1、SOX1蛋白表達情況

2.2 CC組織及細胞中SOX1甲基化程度 CC組織中SOX1啟動子區甲基化比例（%）高于癌旁宮頸組織（45.37±5.12vs.26.73±4.36；n=20，t=12.396，P＜0.01）。宮頸癌HeLa229、ME-180、SiHa、SW756細胞中SOX1啟動子區甲基化比例（%）分別為44.46±5.34、38.15±5.26、40.24±6.0、46.85±6.17，均 高 于Ect1/E6E7細胞（21.84±4.72），差異有統計學意義（n=6，F=18.924，P＜0.01）。

2.3 敲低DNMT1可抑制CC細胞生長 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細胞體外克隆形成數減少（P＜0.05），裸鼠內瘤體質量減輕（P＜0.05），見表1、圖3。

Tab.1 Comparison of the number of HeLa229 and SW756 cell clones and tumor mass between the three groups表1 各組HeLa229和SW756細胞克隆數及瘤體質量比較（n=6，±s）

Tab.1 Comparison of the number of HeLa229 and SW756 cell clones and tumor mass between the three groups表1 各組HeLa229和SW756細胞克隆數及瘤體質量比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與空白組比較，b與DNMT1-NC組比較，P＜0.05；表2～4同

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229克隆數（個/視野）87.46±9.25 92.37±10.16 46.95±8.31ab 43.346＊＊瘤體質量（g）1.58±0.37 1.62±0.41 0.27±0.08ab 34.106＊＊SW756克隆數（個/視野）117.42±13.06 124.76±12.51 61.83±11.49ab 46.425＊＊瘤體質量（g）2.05±0.54 2.11±0.63 0.65±0.07ab 17.718＊＊

2.4 敲低DNMT1可抑制CC細胞遷移和侵襲 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細胞遷移和侵襲數量減少（P＜0.05），見表2、圖4。

Tab.2 Comparison of the migration and invasion numbers of HeLa229 and SW756 cells between the three groups表2 各組HeLa229和SW756細胞遷移及侵襲數量比較（n=6，個/視野，±s）

Tab.2 Comparison of the migration and invasion numbers of HeLa229 and SW756 cells between the three groups表2 各組HeLa229和SW756細胞遷移及侵襲數量比較（n=6，個/視野，±s）

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229遷移數量157.43±11.08 148.96±12.34 73.72±8.65ab 109.244＊＊侵襲數量108.46±7.79 105.29±8.26 46.82±6.59ab 128.712＊＊SW756遷移數量176.57±14.36 185.62±13.25 91.35±10.47ab 99.093＊＊侵襲數量115.33±7.65 109.81±9.07 58.73±7.16ab 91.275＊＊

Fig.3 The cell growth detected by cell cloning and nude mouse tumor formation experiments in the six groups圖3 細胞克隆和裸鼠成瘤實驗檢測各組細胞生長情況

2.5 敲低DNMT1對DNMT1、SOX1蛋白表達及SOX1甲基化的影響 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細胞DNMT1蛋白表達及SOX1啟動子區甲基化比例降低，SOX1蛋白表達增加（P＜0.05），見圖5、表3。

Fig.4 The cell migration and invasion detected byTranswell experiment in the three groups(crystal violet staining,×200)圖4 Transwell實驗檢測各組細胞遷移和侵襲情況（結晶紫染色，×200）

Fig.5 SOX1 and DNMT1 protein expression in each group of cells圖5 各組細胞中SOX1、DNMT1蛋白表達情況

Tab.3 Comparison of SOX1 methylation and DNMT1 and SOX1 protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表3 各組HeLa229和SW756細胞SOX1甲基化和DNMT1、SOX1蛋白表達的比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of SOX1 methylation and DNMT1 and SOX1 protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表3 各組HeLa229和SW756細胞SOX1甲基化和DNMT1、SOX1蛋白表達的比較（n=6，±s）

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F SW756 DNMT1 2.84±0.31 2.91±0.26 1.05±0.19ab 100.129＊＊甲基化（%）47.54±6.27 46.93±7.16 9.35±2.83ab 87.367＊＊SOX1 0.33±0.04 0.38±0.07 3.27±0.65ab 118.869＊＊組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229 DNMT1 2.71±0.27 2.69±0.32 0.84±0.15ab 104.951＊＊甲基化（%）45.18±5.16 43.36±4.27 10.72±2.48ab 132.693＊＊SOX1 0.26±0.05 0.31±0.06 2.84±0.52ab 141.698＊＊

2.6 敲低DNMT1可抑制Wnt/β-catenin通路蛋白表達 與空白組、DNMT1-NC組比較，DNMT1-siRNA組HeLa229和SW756細胞c-Myc、Cyclin D1蛋白表達減少，核/質β-catenin下降（P＜0.05），見圖6、表4。

Fig.6 Expression of c-Myc,Cyclin D1 andβ-catenin protein in each group of cells圖6 各組細胞中c-Myc、Cyclin D1、β-catenin蛋白表達情況

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的重要形式，全基因組低甲基化和局部基因尤其是腫瘤抑制基因高甲基化在癌癥組織中較為常見，在癌癥進展過程中，啟動子的高甲基化會引起不同的腫瘤抑制基因失活，進而調節基因轉錄表達［10］。DNMT1為維持甲基化的重要酶，目前已在多種腫瘤中檢測到DNMT1的高表達，發揮腫瘤促進作用，其中DNMT1在腫瘤前病變到胰腺癌進展過程中表達逐漸增加，可通過維持腫瘤抑制基因啟動子高甲基化抑制其表達，進而促進癌細胞增殖、侵襲并誘導胰腺癌干細胞的自我更新，有望成為胰腺癌的治療靶標［11］。在由良性胃炎到早期的癌前病變，再到胃腸道癌的過程中，DNMT1也顯示表達逐漸增強的趨勢［12］。Tzelepi等［13］在前列腺癌中亦發現，DNMT1高表達，且在淋巴結轉移病例中表達更高，參與腫瘤進展過程的調控。另有研究顯示，DNMT1在大腸癌中高表達，敲除DNMT1可通過提高抑癌基因DYRK2的表達，抑制結直腸癌細胞增殖［14］，也可通過降低miR-152-3p的甲基化抑制TMSB10表達，抑制結直腸癌生長［15］。與Cao等［6］研究一致，本研究也在CC組織和細胞系中檢測到DNMT1高表達，敲低DNMT1可抑制HeLa229和SW756細胞的遷移、侵襲，并在體外和體內均可抑制兩者的增殖，表明在CC進展中DNMT1發揮促進腫瘤作用，但其機制尚需研究。

Tab.4 Comparison of c-Myc,Cyclin D1 andβ-catenin protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表4 各組HeLa229和SW756細胞c-Myc、Cyclin D1、β-catenin蛋白表達比較 （n=6，±s）

Tab.4 Comparison of c-Myc,Cyclin D1 andβ-catenin protein expression in HeLa229 and SW756 cells between the three groups表4 各組HeLa229和SW756細胞c-Myc、Cyclin D1、β-catenin蛋白表達比較 （n=6，±s）

組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F HeLa229 c-Myc 2.53±0.16 2.46±0.23 1.02±0.09ab 150.991＊＊Cyclin D1 2.16±0.15 2.21±0.18 0.84±0.05ab 189.293＊＊核/質β-catenin 1.36±0.14 1.29±0.18 0.54±0.05ab 68.246＊＊組別空白組DNMT1-NC組DNMT1-siRNA組F SW756 c-Myc 2.82±0.24 2.93±0.18 1.25±0.12ab 152.232＊＊Cyclin D1 2.31±0.15 2.37±0.17 1.16±0.11ab 131.820＊＊核/質β-catenin 1.57±0.16 1.46±0.21 0.73±0.15ab 40.692＊＊

SOX蛋白為一類由SOX基因編碼的調節性轉錄因子，可在致癌過程中充當腫瘤抑制因子［16］。SOX1在肝癌等腫瘤中發揮抑癌作用，其低表達與患者預后不良和腫瘤進展相關［17］。SOX1在鼻咽癌細胞系和組織中均表達下調，過表達SOX1可以減弱細胞增殖和遷移，促進細胞分化和衰老［18］。本研究中，SOX1啟動子區甲基化比例在CC組織和細胞系中均較高，SOX1蛋白表達均下調，與Huang等［9］報道一致。敲低DNMT1后發現，HeLa229和SW756細胞中SOX1啟動子區甲基化比例降低，SOX1蛋白表達增加，推測SOX1可能是DNMT1的作用靶點。SOX1在乳腺癌［19］、鼻咽癌［18］、CC［20］中可調節Wnt/β-catenin通路介導的細胞增殖和侵襲，過表達SOX1可抑制上述腫瘤發展。Lin等［20］認為，SOX1在CC中通過抑制Wnt/β-catenin信號通路發揮腫瘤抑制作用；而本研究顯示，敲低DNMT1可使得HeLa229和SW756細胞中c-Myc、Cyclin D1及核/質β-catenin蛋白表達減少，提示敲低DNMT1可能抑制Wnt/β-catenin信號通路，推測下調DNMT1表達可能通過降低SOX1啟動區甲基化程度并上調其蛋白表達，從而抑制Wnt/β-catenin通路介導的CC生長和轉移。

綜上所述，DNMT1在CC組織和細胞中高表達，可能通過維持SOX1啟動區高甲基化并抑制其蛋白表達，促進CC生長和轉移。然而，DNMT1不只調控單一基因的轉錄和表達，CC生長和轉移也不只通過SOX1調節。本研究僅揭示了DNMT1可能通過調節SOX1對CC生長和轉移的作用，后續還需重復驗證，同時繼續研究DNMT1對其他抑癌基因的作用。