長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因7調控卵巢癌細胞遷移和侵襲的機制研究

于利，張明，王迪

卵巢癌是女性惡性腫瘤，其死亡率在婦科惡性腫瘤中排名首位［1］。研究顯示，卵巢癌不僅早期發病隱匿、發展速度快，其還具有轉移能力強、惡性程度高等特點，積極尋找有效手段治療卵巢癌是目前亟待解決的問題［2］。隨著分子生物學及各種實驗技術的不斷發展和成熟，生物靶向治療腫瘤逐漸成為現階段研究的熱點。卵巢癌的發生與組織中基因的表達改變有關，這些基因調控著腫瘤細胞的生長和轉移，是腫瘤惡性進展的關鍵因子。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一個非編碼RNA，其不具備編碼蛋白質的功能，在人體內的各個組織中表達，參與調控眾多生理過程［3］。lncRNA還與人類的疾病發生有關，目前已知其參與心肌損傷、肺炎、關節炎等疾病進程，lncRNA還有望成為疾病治療的靶點［4］。在人類腫瘤中發現多種lncRNA的表達變化，這些lncRNA與腫瘤的轉移相關［5］。lncRNA小核仁RNA宿主基因7（SNHG7）在人類的不同組織中的表達水平不同，其是一個腫瘤調控因子，在胰腺癌、肺癌、乳腺癌等腫瘤中發現SNHG7具有促腫瘤進展的作用，下調SNHG7可以抑制腫瘤細胞的惡性生長和轉移［6-8］。本研究于2019年6—12月探討下調SNHG7對卵巢癌SK-OV-3細胞侵襲以及遷移的影響和機制，為靶向分子治療卵巢癌提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料卵巢癌SK-OV-3細胞購自美國ATCC；波形蛋白（Vimentin）抗體購自武漢艾美捷科技有限公司；Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；實時定量PCR試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由北京安必奇生物科技有限公司合成；上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體購自美國Proteintech。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 細胞轉染卵巢癌SK-OV-3細胞中分別轉染SNHG7干擾表達質粒（SNHG7 shRNA）和陰性對照質粒（shRNA），將轉染以后的細胞分別命名為Sh-SNHG7和Sh-NC組，常規培養的細胞為對照（Control）組。SNHG7 shRNA、shRNA陰性對照均由和元生物技術（上海）股份有限公司構建。

1.3 SNHG7表達水平測定用實時定量PCR方法測定細胞中SNHG7表達變化，步驟如下：收集培養24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞，用Trizol試劑提取細胞總RNA，進行逆轉錄反應，逆轉錄體系為10 μL，包括：0.5 μL的核糖核酸酶抑制劑（RNase Inhibitor）、0.5 μL的dNTP混合物（dNTP mixture）、2 μL的5×PCR緩沖液、0.5 μL的寡核苷酸dT引物（Oligo dT Primer）、1 μL的RNA、5.5 μL的無RNA酶水（RNase free），逆轉錄條件為：37℃、15 min，85℃、5 s，4℃保存。根據以下體系進行PCR反應，包括：0.2 μL的染料（DYE）Ⅰ、3.4 μL的熒光DNA結合染料（SYBR Green）、0.2 μL的正反向引物、1 μL的cDNA、5 μL的RNase free水，PCR反應條件為：95℃30 s，95℃5 s，60℃34 s，40個循環。設置甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，按照常規2-ΔΔCt法計算SNHG7表達量。GAPDH正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，，反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，；SNHG7正 向 引 物5，-CAACTGCCTGAAACCCCATCT-3，，反 向 引 物5，-CGGGTTCAAGCGATTCTCCT-3，。

1.4 細胞增殖能力測定用MTT方法測定細胞增殖能力，細胞增殖能力以A值代表，A值越大，細胞增殖能力也就越強，MTT步驟簡述如下：在96孔板中按照每孔2×103個細胞將Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞分別接種，每孔中添加100 μL的細胞培養液，培養24 h，添加10 μL MTT溶液，孵育4 h后添加150 μL二甲基亞砜（DMSO），酶標儀上測定A470nm值。

1.5 細胞克隆形成能力測定用平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力，步驟簡述如下：將Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞分別接種到6 cm的細胞培養皿內，每個培養皿中加200 μL的濃度為1×103個細胞∕mL的細胞懸浮液，然后添加細胞培養液至5 mL，放在培養箱中培養14 d，此時肉眼可見明顯的細胞集落。將細胞培養液吸掉，加磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次細胞，以4%的多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，干燥以后，顯微鏡下觀察細胞克隆數目。

1.6 細胞侵襲和遷移能力測定將Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞用不含血清的細胞培養液懸浮，侵襲實驗前用基質膠將Transwell小室包被，遷移實驗則不加基質膠。取200 μL上述細胞懸浮液接種到Transwell上室，培養24 h，用棉簽擦除沒有穿膜的細胞，結晶紫染色后，在顯微鏡下觀察計數。

1.7 細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平測定用Western blotting方法檢測Vimentin、E-cadherin蛋白表達，步驟簡述如下：收集培養24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞，將上清溶液棄掉，添加含有苯甲基磺酰氟（PMSF）的放射免疫沉淀分析裂解液（RIAP），放在冰上充分裂解，轉移到離心管內，在4℃條件下以12 000g離心20 min，吸取上清，用二辛可寧酸（BCA）方法測定濃度。按照常規方法分別制備實驗用分離膠以及濃縮膠，設置分離膠中電泳電壓為100 V，濃縮膠中電泳電壓為80 V。染料進入到分離膠的底部以后將電源關閉。取出凝膠，在4℃轉膜，轉膜電壓設置為60 V，轉膜持續40 min。轉膜結束后取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF），經過5%牛血清白蛋白封閉以后，分別與一抗、二抗依次結合后，用電化學發光液（ECL）方法顯色，設置GAPDH作為內參，分析Vimentin、E-cadherin蛋白表達量。

1.8 SNHG7靶向關系預測和鑒定用starbase生物信息軟件發現SNHG7和miR-34a有互補結合位點，二者可能互為靶向關系。以熒光素酶報告系統鑒定靶向關系，分別將SNHG7野生型熒光素酶報告質粒（SNHG7-WT）、突變型熒光素酶報告質粒（SNHG7-MUT）同miR-34a模擬物（miR-34a mimics）及陰性對照（mimics control）共轉染到SK-OV-3細胞中，24 h后檢測熒光素酶活性變化，步驟同熒光素酶活性檢測試劑盒。SNHG7-WT、MUT分別為含有SNHG7的結合序列和含有突變以后的SNHG7結合序列的熒光素酶報告載體，載體由中洪博元生物集團有限公司構建。miR-34a mimics、mimics control購自上海吉瑪制藥技術有限公司。收集培養24 h后的Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞，用實時定量PCR方法測定細胞中miR-34a表達變化，步驟同1.3，內參為核小分子RNA（U6）。

1.9 miR-34a inhibitor對下調SNHG7影響卵巢癌細胞的作用檢測卵巢癌SK-OV-3細胞中分別共轉染SNHG7 shRNA+miR-34a抑制劑（miR-34a inhibitor）和SNHG7 shRNA+miR-34a抑制劑陰性對照（inhibitor control），依次命名為Sh-SNHG7+anti-miR-34a和Sh-SNHG7+anti-miR-NC組，按照1.4（MTT）、1.5（克隆形成實驗）、1.6（Transwell小室）、1.7（Western blotting）中方法測定細胞增殖、克隆、侵襲遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達。

1.10 統計學方法用SPSS 21.0軟件分析，計量資料用±s表示，兩組數據間比較經成組t檢驗，多組差異比較用單因素方差析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG7 shRNA對卵巢癌細胞增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響與Sh-NC組比較，Sh-SNHG7組卵巢癌細胞中SNHG7表達水平降低，細胞增殖（A值）降低，克隆數目減少，侵襲和遷移數目減少，Vimentin蛋白表達量減少，E-cadherin蛋白表達量升高，見圖1和表1。SNHG7 shRNA下調卵巢癌細胞中SNHG7表達水平，降低卵巢癌細胞增殖、克隆、遷移以及侵襲能力。

表1 SNHG7 shRNA轉染后的卵巢癌細胞中SNHG7水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平比較∕±s

表1 SNHG7 shRNA轉染后的卵巢癌細胞中SNHG7水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平比較∕±s

注：SNHG7為小核仁RNA宿主基因7，Control為對照組，Sh-NC為轉染SNHG7陰性對照質粒組，Sh-SNHG7為轉染SNHG7干擾表達質粒組，A值為吸光度值，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白。①與Sh-NC比較，P＜0.05。

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圖1 Western blotting檢測SNHG7 shRNA轉染后的卵巢癌細胞中Vimentin、E-cadherin蛋白表達

2.2 SNHG7靶向調控miR-34aSNHG7和miR-34a有堿基互補結合位點，miR-34a mimics和SNHG7-WT共轉染后的卵巢癌細胞熒光素酶活性下降（0.48±0.05）比（1.00±0.11），t=12.91，P＜0.001。SNHG7靶向調控miR-34a。見圖2。

圖2 SNHG7和miR-34a堿基互補結合位點

2.3 下調SNHG7促進卵巢癌細胞中miR-34a表達Control、Sh-NC、Sh-SNHG7組細胞中miR-34a水平分別為（1.00±0.11）、（0.98±0.10）、（2.64±0.21）。與Sh-NC組比較，Sh-SNHG7組卵巢癌細胞中miR-34a水平升高（P＜0.05）。下調SNHG7促進卵巢癌細胞中miR-34a表達。

2.4 miR-34a inhibitor對下調SNHG7的卵巢癌細胞增殖、克隆、遷移、侵襲以及Vimentin、E-cadherin蛋白表達影響與Sh-SNHG7+anti-miR-NC組比較，Sh-SNHG7+anti-miR-34a組卵巢癌細胞中miR-34a水平降低，SK-OV-3細胞增殖能力升高，SK-OV-3細胞克隆形成數、侵襲以及遷移數增多，Vimentin蛋白表達水平升高，E-cadherin蛋白表達水平下降，見圖3，表2。

表2 miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共轉染后卵巢癌細胞中miR-34a水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平比較∕±s

表2 miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共轉染后卵巢癌細胞中miR-34a水平、增殖、克隆、侵襲、遷移和Vimentin、E-cadherin蛋白表達水平比較∕±s

注：miR-34a為微小RNA-34a，SNHG7為小核仁RNA宿主基因7，Vimentin為波形蛋白，E-cadherin為上皮鈣黏蛋白，Sh-SNHG7+anti-miR-NC為共轉染SNHG7 shRNA和miR-34a抑制劑陰性對照，Sh-SNHG7+anti-miR-34a為共轉染SNHG7 shRNA和miR-34a抑制劑，A值為吸光度值。①與Sh-SNHG7+anti-miR-NC比較，P＜0.05。

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圖3 Western blotting檢測miR-34a inhibitor和SNHG7 shRNA共轉染后卵巢癌細胞中Vimentin、E-cadherin水平

3 討論

lncRNA是不能編碼蛋白質的RNA分子，其長度大于200 bp，在細胞增殖、個體發育等多種生物學過程中發揮調控作用［9］。lncRNA參與腫瘤進展，可能是腫瘤分子靶向治療的生物靶標［10］。SNHG7是在人體組織中發現的lncRNA，其在不同組織中的表達不同，并且參與人體多種腫瘤的進展，目前在膀胱癌、非小細胞肺癌等組織中發現SNHG7異常表達，SNHG7表達改變影響細胞的生長以及轉移過程，SNHG7可能是腫瘤治療的有效靶點［6，11］。本研究結果表明，下調SNHG7后的卵巢癌細胞增殖、克隆能力下降，提示下調SNHG7具有抗卵巢癌細胞生長的作用，這與上述研究結果相符合，進一步說明了SNHG7在癌癥中可能發揮類似癌基因的作用。

卵巢癌轉移能力極強，其細胞轉移是卵巢癌患者死亡的重要原因［12］。研究顯示，上皮間質轉化（EMT）是腫瘤轉移的重要標志，發生EMT后的轉移能力大大增加［13］。Vimentin、E-cadherin表達變化是EMT能力改變的可靠指標［14］。Vimentin還可以作為一種癌基因促進腫瘤進展。E-cadherin在腫瘤中表達下調，其表達上調后可以抑制腫瘤惡性轉移［15］。本研究結果顯示，下調SNHG7后卵巢癌細胞侵襲以及遷移能力降低，Vimentin表達水平減少，E-cadherin表達水平升高，提示上調SNHG7抑制卵巢癌細胞的轉移潛能。

lncRNA廣泛參與人體生理以及病理進程，并且在不同的組織及生理過程中的作用不同。lncRNA的調控機制復雜，這也是其功能多樣的重要原因［16］。lncRNA可以通過不同靶向調控機制影響細胞的生長、組織分化，目前其調控機制還未完全闡明［17］。lncRNA可以通過堿基互補的方式影響miRNA的表達，從而通過多個調控網絡影響細胞生物學行為［18］。本次實驗表明，SNHG7和miR-34a互為靶向關系，并且下調SNHG7可以靶向促進卵巢癌細胞中miR-34a的表達。miR-34a是一個腫瘤關系密切的miRNA，參與調控腫瘤細胞的轉移過程［19］。研究顯示，miR-34a在骨肉瘤、肺癌、卵巢癌等中下調表達，影響細胞的生長和轉移［20-24］。本實驗顯示，抑制miR-34a逆轉下調SNHG7對卵巢癌細胞生長和轉移潛能的抑制作用，提示下調SNHG7可以靶向促進miR-34a的表達阻礙卵巢癌進展。

綜上，下調SNHG7表達可以在體外阻礙卵巢癌細胞的生長和轉移，作用機制與靶向促進miR-34a的表達有關。我們的實驗結果為研究SNHG7在卵巢癌中的網絡調控作用提供了資料，為尋找有效的卵巢癌治療生物靶標提供可思路。