腫瘤蛋白53靶基因1靶向微小RNA-33a對膠質瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響

李小萌，喬潛林

膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤，約占腦 腫瘤的40%～60%［1］。膠質瘤細胞增殖較快、侵襲性較強，雖然神經腫瘤學已取得了長足的進展，但膠質瘤病人預后較差、死亡率仍然居高不下［2-3］。深入探索膠質瘤發生分子機制，尋找可靠診斷和治療靶點是當前亟待解決的重要問題。長鏈非編碼RNA（lncRNAs）是蛋白編碼功能缺失但長度超過200個核苷酸的RNA，隨著對lncRNAs和腫瘤相關性研究的不斷深入，lncRNA在腫瘤發生發展中的作用被不斷揭示［4］。近年來研究顯示，在非小細胞肺癌中腫瘤蛋白53靶基因1（tumor protein 53 target gene 1，TP53TG1）表達下調，過表達TP53TG1可增強非小細胞肺癌細胞順鉑敏感性、促進細胞凋亡［5］；在胰腺癌中，TP53TG1表達上調，下調TP53TG1抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡［6］。在人神經膠質瘤細胞中，TP53TG1表達下調［7］，但TP53TG1對膠質瘤生物行為的影響及其機制尚未完全闡明。因此，本研究從2019年1—6月開展體外實驗，通過觀察TP53TG1對膠質瘤細胞惡性行為的影響，初步探索其分子機制，以期為基于TP53TG1防治膠質瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人正常神經膠質細胞HA和神經膠質瘤細胞U251購于上海斯信生物科技有限公司；LipofectamineTM2000轉染試劑購于Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega公司；MTT細胞增殖檢測試劑盒、Annexin V-FITC∕PI試劑盒、TRIzol購于北京索萊寶生物科技有限公司；Western blotting相關試劑購于生工生物工程有限公司；pcDNA3.1、pcDNA3.1-TP53TG1、TP53TG1的小干擾RNA（si-TP53TG1）、TP53TG1野生型熒光素酶報告質粒（WT-TP53TG1）、miRNA模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-33a模 擬 物（mimics）、si-NC和TP53TG1突變型熒光素酶報告質粒（MUTTP53TG1）的構建和測序以及PCR引物均由上海英駿生物公司提供；兔源細胞周期蛋白D1（CyclinD1）抗體、兔源細胞周期蛋白激酶抑制劑（P21）抗體、兔源B細胞淋巴瘤（Bcl-2）抗體、兔源Bcl相關x蛋白（Bax）多抗體、兔源基質金屬蛋白酶（MMP-2）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）羊抗鼠及羊抗兔抗體購于Abcam公司；鼠源E鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體購于Santa Cruz公司；Transwell小室和Matrigel基質膠購于Corning公司。

1.2 細胞培養、轉染和實驗分組HA和U251細胞均采用DMEM培養基（胎牛血清含量為10%）在37℃、含5%二氧化碳、培養箱孵育。將對數期U251細 胞 以2×105個∕孔 接 種6孔 板，利 用LipofectamineTM2000將pcDNA3.1、pcDNA3.1-TP53TG1分別轉染至匯合度為60%的U251細胞，依次標記為pcDNA3.1組、pcDNA3.1-TP53TG1組，培養24～72 h后，進行后續實驗分析。

為驗證TP53TG1是通過調控miR-33a表達進而影響膠質瘤細胞生物學行為，把miR-33a mimics分別與pcDNA3.1或pcDNA3.1-TP53TG1共轉染至U251細胞，依次標記為pcDNA3.1-TP53TG1+miRNC組和pcDNA3.1-TP53TG1+miR-33a組，檢測U251細胞的增殖、遷移侵襲以及凋亡情況。

1.3 qRT-PCR檢測用TRIzol試劑分離總RNA。首先合成cDNA模板，再按照說明書進行qPCR擴增。采用2-ΔΔCt法計算TP53TG1相對表達量（GAPDH為內參）。

1.4 雙熒光素酶報告基因檢測利用生物信息學軟件在線預測TP53TG1靶基因發現，TP53TG1與miR-33a存在連續結合位點。構建野生型WT-TP53TG1和突變型MUT-TP53TG1熒光素酶報告載體，將miR-33a mimics和miR-NC分別與WT-TP53TG1或MUT-TP53TG1同時轉染至U251細胞，測定培養48 h后各組細胞的熒光素酶活性。

1.5 MTT法檢測細胞活力取對數期U251細胞按照2×103個∕孔接種于96孔板，按照1.2進行相應處理后，每培養24 h取出一組平板，每孔加入MTT試劑20 μL，孵育4 h后，棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，再孵育2 h溶解結晶，酶標儀測定490 nm處各孔的OD值。

1.6 Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力侵襲實驗：經胰酶消化轉染48 h的細胞，用不含血清的DMEM培養基重懸，調整細胞濃度約為1×106∕mL。向包被Matrigel基質膠的Transwell上室、24孔板下室分別加入200 μL細胞懸液、500 μL完全培養基，培養24 h，用甲醇固定Transwell膜下表面30 min，0.5%結晶紫溶液染色10 min。自來水沖洗去除多余染液，在倒置顯微鏡下隨機選取5個視野拍照、計數，取均值表示細胞侵襲數。遷移實驗時不用Matrigel基質膠包被Transwell小室，其余步驟同上。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡加入適量的1×Binding Buffer懸浮轉染48 h細胞使其濃度達到1×106個∕mL。向流式管內加入100 μL懸液，然后依次加入5 μL Annexin V-FITC、5 μL的PI，室溫避光孵育15 min，加入PBS液至500 μL，混合均勻后于1 h之內用流式細胞儀評估細胞凋亡。

1.8 Western blotting檢測RIPA裂解法提取總蛋白，取適量蛋白煮沸3 min使其變性。每組用30 μg蛋白進行SDS-PAGE，濕法將蛋白轉移至PVDF膜。Western封閉液阻斷膜，洗膜后，分別加入已稀釋的抗Cyclin D1（1∶500）、P21（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶500）、MMP-2（1∶500）、E-cadherin（1∶500）和GAPDH（1∶2 500）的Ⅰ抗4℃孵育過夜。再次洗膜后，加入Ⅱ抗稀釋液室溫孵育1 h，化學發光顯色后拍照，成像掃描分析系統測定目的條帶相對于GAPDH的灰度值。

1.9 統計學方法用SPSS 20.0進行統計分析，本研究中所有計量資料均采用±s表示，兩組間比較時采用t檢驗，多組間比較時采用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞HA和U251中TP53TG1的表達情況與人正常神經膠質細胞HA相比，神經膠質瘤細胞U251中TP53TG1的表達顯著降低，（1.03±0.10）比（0.28±0.03），差異有統計學意義（t=21.551，P＜0.001）。

2.2 過表達TP53TG1對細胞U251增殖、凋亡的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組TP53TG1的表達顯著升高，P21和Bax蛋白的表達顯著升高，Cyclin D1和Bcl-2蛋白的表達顯著降低，細胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高（P＜0.001）。表明，過表達TP53TG1可抑制U251細胞增殖，促進細胞凋亡。見圖1，表1。

圖1 過表達腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）對細胞U251增殖、凋亡的影響

表1 過表達TP53TG1對細胞U251增殖的影響∕±s

表1 過表達TP53TG1對細胞U251增殖的影響∕±s

注：TP53TG1為腫瘤蛋白53靶基因1，pcDNA3.1為空載體質粒，pcDNA3.1-TP53TG1為TP53TG1的過表達質粒。

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2.3 過表達TP53TG1對細胞U251遷移、侵襲的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組U251細胞遷移和侵襲數減少［（138±14.01）個 比（72±7.26個）、（126±12.54）個 比（65±6.63）個，t=12.548、12.901，均P＜0.001］，MMP-2蛋白水平降低［（0.63±0.06）比（0.21±0.02），t=19.922，P＜0.001］，Ecadherin蛋白水平升高［（0.33±0.03）比（1.02±0.10），t=19.827，P＜0.001］，過表達TP53TG1可抑制U251細胞遷移和侵襲。見圖2。

圖2 過表達TP53TG1對細胞U251 E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響

2.4 TP53TG1靶向調控miR-33a表達生物信息學軟件在線預測到TP53TG1和miR-33a存在結合位點，見圖3。與miR-NC、WT-TP53TG1共轉染組相比，miR-33a、WT-TP53TG1共轉染組U251細胞的熒光素酶活性顯著降低［（1.04±0.10）比（0.32±0.03），t=20.689，P＜0.001］；與miR-NC、MUT-TP53TG1共轉染組相比，miR-33a、MUT-TP53TG1共轉染組U251細胞的熒光素酶活性無顯著變化［（1.02±0.10）比（1.06±0.10），t=0.849，P=0.409］。與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組U251細 胞miR-33a的 表達水平顯著降低，（1.03±0.10）比（0.43±0.04），t=16.713，P＜0.05；與si-NC組 比 較，si-TP53TG1組U251細胞miR-33a的表達水平顯著升高，（1.04±0.10）比（1.76±0.18），t=10.490，P＜0.001。以上結果表明，TP53TG1靶向負調控miR-33a表達。

圖3 腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）靶向miR-33a

2.5 過表達miR-33a能逆轉TP53TG1對細胞U251增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-TP53TG1組U251細胞活力、miR-33a表達以及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白水平降低，凋亡率以及P21、Bax和E-cadherin蛋白水平升高，遷移數和侵襲數減少；與pcDNA3.1-TP53TG1+miR-NC組 比 較，pcDNA3.1-TP53TG1+miR-33a組U251細胞細胞活力、miR-33a表達以及Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白水平升高，凋亡率以及P21、Bax和E-cadherin蛋白水平降低，遷移數和侵襲數增多（P＜0.001）。以上結果表明，過表達miR-33a能夠逆轉TP53TG1對細胞U251增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。見圖4，表2。

表2 過表達miR-33a能逆轉腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）對細胞U251細胞活性的影響∕±s

表2 過表達miR-33a能逆轉腫瘤蛋白53靶基因1（TP53TG1）對細胞U251細胞活性的影響∕±s

注：①與pcDNA3.1組比較，P＜0.05。②與pcDNA3.1-TP53TG1+miR-NC組比較，P＜0.05。

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圖4 過表達miR-33a能逆轉TP53TG1對細胞U251凋亡及Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2蛋白表達的影響：A為過表達miR-33a能逆轉TP53TG1對細胞U251凋亡的影響；B為過表達miR-33aCyclin D1、P21、Bax、Bcl-2、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達

3 討論

膠質瘤是最常見的原發性顱內腫瘤［8］。盡管有手術和放化療等治療手段，膠質瘤的發病率和死亡率仍然很高［1］。闡明膠質瘤的發生發展的分子機制，開發更有效的診治療方法，對改善膠質瘤病人預后，提高生存率具有重大意義。

lncRNA是活躍的生物分子，在許多腫瘤中發揮重要的調控作用。多項研究表明，lncRNA參與調控神經膠質瘤的生長、轉移和耐藥等多種生物學過程的調控［9-11］。TP53TG1是p53誘導的lncRNA，在人類癌癥的進展中起著至關重要的作用。本研究探索了TP53TG1在膠質瘤進展中的作用，結果顯示膠質瘤細胞中TP53TG1表達下調，這與包雯等［12］的研究結論相吻合，可能與TP53TG1啟動子CpG島高甲基化有關，TP53TG1表達的恢復與結腸直腸癌和胃癌細胞的侵襲和遷移能力降低相關［13］。Cyclin D1是重要的細胞周期蛋白，主要通過促進細胞從G1期進入S期發揮細胞增殖正性調控作用，而P21則發揮相反的作用［14］。Bcl-2家族在細胞凋亡中具有重要作用，促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2的比例是細胞凋亡發生的關鍵［15］。E-cadherin是上皮細胞標志物，腫瘤細胞中E-cadherin表達下調，而MMP-2表達上調則通過降解細胞外基質促進腫瘤的侵襲和轉移［16］。本研究發現過表達TP53TG1在抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲誘導凋亡，伴隨著P21、E-cadherin和Bax蛋白水平的增加以及Cyclin D1、MMP-2和Bcl-2蛋白水平的下降。提示TP53TG1在膠質瘤中發揮抑癌基因作用。

近年來，lncRNA通過與miRNA相互作用調控腫瘤發生發展的機制被廣泛報道。為揭示TP53TG1調控膠質瘤發生發展的分子機制，利用生物信息學軟件進行靶基因預測發現，miR-33a是TP53TG1的潛在靶基因。隨后的雙熒光素酶報告基因實驗證實了TP53TG1和miR-33a的靶向關系，并通過Western blotting證實在膠質瘤中miR-33a的表達到受到TP53TG1的負性調控。miR-33a是一種內含子miRNA，位于固醇反應原件結合蛋白基因SREBF2的內含子序列中，在調節膽固醇和脂肪酸代謝中發揮重要作用［17］。研究顯示，miR-33a在膠質瘤組織和細胞中表達上調，高表達miR-33a的膠質瘤病人腫瘤體積較大、生存率較低，敲除miR-33a可抑制膠質瘤的生長［18］。此外，miR-33a高表達還可促進膠質瘤細胞的自我更新［19-20］。于是，本研究推測TP53TG1通過負性調控miR-33a表達抑制膠質瘤的發生發展。為證實TP53TG1的抗膠質瘤作用依賴于miR-33a表達下調，本研究將pcDNA3.1-TP53TG1和miR-33a mimics共轉染膠質瘤細胞進行恢復實驗，結果顯示過表達miR-33a可顯著逆轉TP53TG1對膠質瘤細胞活力、遷移數、侵襲數、凋亡率以及對應蛋白水平的影響。

綜上所述，TP53TG1在膠質瘤細胞中表達下調，上調TP53TG1通過靶向miR-33a抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡，TP53TG1有望成為膠質瘤的潛在診療靶點。