超聲造影定量參數聯合血清微小RNA-139-5p、微小RNA-15a檢測在卵巢漿液性囊腺癌病人中應用價值

馬艷紅，阮青青，梁志，舒嚴蘋

卵巢癌為婦科常見惡性腫瘤，有關研究指出，因卵巢組織解剖、胚胎發育、內分泌功能較復雜，卵巢癌發病早期并無明顯癥狀，70%左右病人在疾病確診時已進展至晚期，腫瘤發生遠處轉移，放化療與根治手術效果均不佳，病人5年生存率僅30%［1-3］。探尋一種卵巢癌早期鑒別診斷方法一直為臨床研究重點課題。超聲造影為惡性腫瘤定性診斷的重要影像學手段，經由靜脈團注造影劑，能加強靶區域血流信號，更為清晰地顯示微小血管灌注狀態，有利于病灶檢出，同時具有無創、操作便捷等特點，但臨床實踐發現，其在疾病早期的診斷效果較差［4-5］。mi RNAs為一類內源性小分子RNA，可阻止目標蛋白翻譯或靶向降解目標m RNA分子起到多種生物學作用，與腫瘤發病、進展、預后等具有密切關 系［6-7］。微 小RNA-139-5p（miR-139-5p）、微 小RNA-15a（miR-15a）均為調節人體細胞生長、增殖的重要mi RNAs，在惡性腫瘤病人中其表達異常改變，可為疾病早期診斷提供一定參考［8-9］。本研究擬首次聯合超聲造影定量參數與血清miR-139-5p、miR-15a檢測，旨在分析兩者聯合檢測在卵巢漿液性囊腺癌病人中應用價值及意義。詳情如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年6月至2019年9月重慶市北碚區中醫院收治的92例卵巢漿液性囊腺癌病人為腺癌組（年齡范圍為23～75歲，體質量范圍為41～82 kg）及92例卵巢漿液性囊腺瘤病人為腺瘤組（年齡范圍為25～74歲，體質量范圍為40～81 kg）。兩組年齡、體質量、絕經狀態、合并癥等基線資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 卵巢癌及卵巢良性腫瘤病人各92例一般資料比較

腺癌組病理分期為Ⅰ～Ⅱ期34例（36.96%）、Ⅲ～Ⅳ期58例（63.04%），淋巴結轉移43例（46.74%）。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求，獲得病人或其近親屬知情同意。

1.2 選例標準（1）納入標準：腺癌組均符合《婦產科學》［10］中卵巢漿液性囊腺癌臨床診斷標準，且通過病理檢查證實；腺瘤組卵巢漿液性囊腺瘤（腺瘤組）均經臨床與病理檢查證實；研究對象自愿納入研究。（2）排除標準：合并嚴重感染與其他類型惡性腫瘤者；合并免疫系統、精神系統、血液系統疾病者；合并心、肝、腎、肺等臟器功能嚴重異常者；存在超聲造影檢查禁忌癥或對造影劑過敏者。

1.3 方法

1.3.1超聲造影檢查方法應用彩色多普勒超聲診斷儀（Philips，iU Elite）施行檢查，探頭頻率為3.5 MHz，造影劑應用由意大利Bracco公司生產的聲諾維超聲造影劑，低機械指數（MI＜0.1）實時灰階諧波超聲造影。檢查前囑咐受檢者憋尿，適度充盈膀胱；檢查時受檢者仰臥，先采取常規灰階超聲檢查子宮及卵巢大小、位置與腫瘤數目、大小、邊界、形態等情況；后選取最佳切面，切換到造影模式，使用C5-1經腹探頭；經肘正中靜脈團注2 mL造影劑，從造影劑注射開始持續觀察整個造影過程，以硬盤存錄約3 min；造影結束后，觀察、記錄病灶的增強水平、增強時間、造影劑分布情況；應用Philips QLab定量分析軟件實施定量分析，選取病灶部位感興趣區域，由軟件自動繪制出超聲造影時間-強度曲線，獲得始增時間、達峰時間、增強強度等超聲造影參數值。

1.3.2血清miR-139-5p、miR-15a水平檢測采集受檢者4 mL清晨空腹靜脈血樣，應用離心機以3 000 r∕min轉速、8 cm離心半徑離心5 min，取血清，-80℃冰箱中儲存待檢；依據Qiagen公司提供的總RNA提取試劑盒miRNeasy Serum∕Plasma Kit說明書進行總RNA的提取，應用NANODROP 2000檢測血清RNA水平，-80℃下保存獲得的RNA。而后按Qiagen公司提供的miScriptⅡRT Kit試劑盒說明書進行反轉錄，配制20 μL反應體系；有關引物序列：miR-139-5p正向 引 物5’-UCUACAGUGCACGUGUCUC-CAGU-3’，miR-15a正向引物5’-TAGCAGCACATAATGGTTTGTG-3’，反向引物均為試劑盒所提供引物；內參U6的正向引物5’-GTGCTC-CCTGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，反 向 引 物5’-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3’，反應條件：95℃下10 min，95℃下10 s，60℃下60 s，72℃下延伸3 min，40個循環；以2-ΔΔCt計算血清miR-139-5p、miR-15a相對表達量。

1.4 觀察指標（1）兩組超聲造影定量參數（始增時間、達峰時間、增強強度）、血清miR-139-5p、miR-15a水平。（2）應用logistic回歸分析探討超聲造影定量參數（始增時間、達峰時間、增強強度）、血清miR-139-5p、miR-15a與卵巢漿液性囊腺癌的相關性。（3）受試者工作特征（ROC）曲線分析超聲造影定量參數（始增時間、達峰時間、增強強度）、血清miR-139-5p、miR-15a對卵巢漿液性囊腺癌的診斷效能。（4）淋巴結有無轉移、卵巢漿液性囊腺癌病人超聲造影定量參數（始增時間、達峰時間、增強強度）、血清miR-139-5p、miR-15a水平。（5）Pearson相關性分析探討超聲造影定量參數（始增時間、達峰時間、增強強度）、血清miR-139-5p、miR-15a水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結轉移關系。

1.5 統計學方法以SPSS 22.0軟件包實施數據處理；計量資料以±s表示、兩組定量數據的比較采用獨立樣本t檢驗；logistic回歸分析觀察超聲造影定量參數、血清各指標與卵巢漿液性囊腺癌發病的相關性；繪制ROC曲線分析超聲造影定量參數、血清各指標對卵巢漿液性囊腺癌的診斷效能；Pearson相關性探討超聲造影定量參數、血清各指標與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結轉移關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組超聲造影定量參數、血清miR-139-5p、miR-15a水平腺癌組超聲造影定量參數的始增時間、達峰時間、血清miR-15a水平低于腺瘤組，超聲造影定量參數的增強強度、血清miR-139-5p水平高于腺瘤組（P＜0.05）。見表2。

表2 卵巢漿液性囊腺癌及卵巢漿液性囊腺瘤病人超聲造影定量參數、血清miR-139-5p、miR-15a水平比較∕±s

表2 卵巢漿液性囊腺癌及卵巢漿液性囊腺瘤病人超聲造影定量參數、血清miR-139-5p、miR-15a水平比較∕±s

注：miR-139-5p為微小RNA-139-5p，miR-15a為微小RNA-15a。

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2.2 超聲造影定量參數、血清各指標與卵巢漿液性囊腺癌的相關性以是否發生卵巢漿液性囊腺癌為因變量，將受試者超聲造影定量參數的始增時間、達峰時間、增強強度、血清miR-139-5p、miR-15a為自變量實施logistic回歸分析，結果顯示，超聲造影定量參數的始增時間、達峰時間、增強強度、血清miR-139-5p、miR-15a均與卵巢漿液性囊腺癌具有明顯相關性（P＜0.05）。見表3。

表3 超聲造影定量參數、血清各指標與卵巢漿液性囊腺癌的相關性

2.3 各指標診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線聯合診斷卵巢漿液性囊腺癌的AUC為0.896，均高于單一指標，兩者聯合診斷卵巢漿液性囊腺癌的敏感度為90.22%，特異度為78.26%。見表4。

表4 各指標診斷卵巢漿液性囊腺癌的ROC曲線

2.4 淋巴結有無轉移卵巢漿液性囊腺癌病人各指標水平有淋巴結轉移卵巢漿液性囊腺癌病人超聲造影定量參數的始增時間、達峰時間與血清miR-15a水平低于無淋巴結轉移病人，超聲造影定量參數的增強強度與血清miR-139-5p水平高于無淋巴結轉移病人（P＜0.05）。見表5。

表5 卵巢漿液性囊腺癌病人92例有無淋巴結轉移的指標水平比較∕±s

表5 卵巢漿液性囊腺癌病人92例有無淋巴結轉移的指標水平比較∕±s

注：miR-139-5p為微小RNA-139-5p，miR-15a為微小RNA-15a。

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2.5 各指標水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結轉移關系Pearson相關性分析可知，超聲造影定量參數的始增時間（r＝-4.872、P＜0.001）、達峰時間（r＝-4.694、P＜0.001）及血清miR-15a（r＝-5.129、P＜0.001）水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結轉移呈顯著負相關，超聲造影定量參數的增強強度（r＝4.796、P＜0.001）及 血 清miR-139-5p（r＝4.235、P＜0.001）水平與卵巢漿液性囊腺癌病人淋巴結轉移呈顯著正相關。

3 討論

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤，其中以卵巢漿液性囊腺癌最為常見，卵巢漿液性囊腺癌發病早期缺少典型癥狀，易造成漏診及誤診，延誤最佳治療時機，影響病人預后，探尋靈敏的早期診斷方法一直為臨床關注重點［11-12］。相關研究報道，卵巢腫瘤發病、進展均和腫瘤病灶中新生血管生成具有密切關系，且良惡性卵巢腫瘤血管解剖學與血流動力學存在明顯差異，有效鑒別此特征可為腫瘤定性診斷提供有力參考［13］。

常規彩超為卵巢腫瘤常用診斷方法，雖可為腫瘤定性診斷提供一定參考信息，但對腫瘤內微小血管、低速血流及位置較深腫瘤內血流顯示效果欠佳，診斷準確性較差。超聲造影在揭示腫瘤血流灌注情況方面具有更高敏感性，可顯示出直徑200 μm以下微小血管，完整地顯示病灶附近及內部血液供應，特別是低速微小血管，且能顯示病灶內不同區域灌注強度及灌注、消退順序；同時，超聲造影劑于血流中有著較強散射作用，能強化二維超聲影像與血流多普勒信號，清晰顯示病灶內血流信號，更準確評估腫瘤中包含血管狀況，克服腫瘤深度、血管直徑等對血流顯示率的影響，提升腫瘤定性診斷敏感性［14］。楊阿芳［15］研究指出，卵巢漿液性囊腺癌病人的超聲造影增強強度高于良性卵巢腫瘤病人，達峰時間低于良性卵巢腫瘤病人。本研究中對卵巢漿液性囊腺癌及漿液性囊腺瘤進行觀察發現，卵巢漿液性囊腺癌的增強超聲參數與漿液性囊腺瘤存在明顯的差別，增強強度較高，而超聲造影的始增時間、達峰時間短，超聲造影定量參數中始增時間能反映造影劑在瘤體內出現時間，達峰時間能反映病灶血管床內造影劑至最大劑量所需時間，增強強度能反映血管生成密度。相較于良性腫瘤，惡性腫瘤血管密度更高，管徑更粗，易形成血管袢或血管網，且血管通透性高，血管壁較薄，注入造影劑之后，腫瘤病灶血管中微泡流速更快，導致其始增時間、達峰時間短，增強強度高［16］。結果說明卵巢漿液性囊腺癌的血流特性在超聲造影上能夠表現出特征性的表現，在進一步的多因素回歸分析也顯示，超聲造影的各個參數均與卵巢漿液性囊腺癌具有明顯相關性。證實超聲造影可為卵巢漿液性囊腺癌診斷提供有力參考。

miRNAs可廣泛參與體內細胞生長、分化、衰亡等生命活動調節過程，近期研究發現，循環內miRNAs可為多種腫瘤早期診斷與預后評價提供有力依據［17-18］。相關研究報道，miR-15、miR-139等均與惡性腫瘤發生、進展具有密切關系［19-20］。本研究中，卵巢漿液性囊腺癌病人血清miR-15a水平降低，血清miR-139-5p水平增高，且其與卵巢漿液性囊腺癌發病具有明顯相關性。miR-15家族于腫瘤發病、進展中可起到抑癌基因作用，經由靶向調節Bcl-2凋亡抑制基因表達，促使細胞衰亡；且可經調節E2F1表達，阻止細胞增殖；同時，有研究指出，miR-15a還可調節BMI1表達影響惡性腫瘤侵襲與轉移［21］。miR-139-5p的表達與腫瘤的侵襲性有關，劉換新等［22］研究指出，在胃癌病人中miR-139-5p表達可降低，起到抑癌作用。王秀新等［23］研究報道，在前列腺癌病人中miR-139-5p表達可增高，起到促癌作用。近期研究發現，在卵巢漿液性囊腺癌病人中miR-139-5p表達可增高，且與淋巴結轉移及病人預后具有密切關系［24-25］。而在本研究資料中發現，卵巢漿液性囊腺癌伴有淋巴結轉移的病人，miR-15的表達下調，而miR-139的表達水平明顯升高，提示其表達的變化參與了腫瘤的侵襲轉移過程，而在超聲造影的參數也表現出明顯的差異，提示miR-15、miR-139也可能在卵巢漿液性囊腺瘤血管生成中具有調節作用。

在進一步的研究中的ROC曲線顯示，超聲造影定量參數與血清指標聯合診斷卵巢漿液性囊腺癌的AUC為0.896，具均高于單一指標，具有較好的診斷效能。提示采用超聲造影定量參數聯合血清miR-139-5p、miR-15a檢測可顯著提升卵巢漿液性囊腺癌早期診斷效能。可能與超聲造影定量參數、血清miR-139-5p、miR-15a診斷卵巢漿液性囊腺癌的途徑不同，結合使用可為疾病診斷提供更多參考信息有關。

綜上所述，卵巢漿液性囊腺癌超聲增強掃描參數具有特征性的改變，同時血清miR-139-5p表達上調、miR-15a表達下降，并且與腫瘤的淋巴結轉移有關，聯合應用超聲造影定量參數與血清miR-139-5p、miR-15a檢測能增強卵巢漿液性囊腺癌早期診斷效能，可為臨床診治提供一定參考。