Toll樣受體2、Toll樣受體4 mRNA和蛋白在急性出血壞死性胰腺炎肝損傷中的表達(dá)及意義

蔡青云，楊留生，張賀川

急性胰腺炎是外科常見的急腹癥之一［1-2］。臨床表現(xiàn)為起病急、進(jìn)展快、惡化快、病情兇險(xiǎn)、并發(fā)癥嚴(yán)重等［3］。急性出血壞死性胰腺炎（AHNP）是臨床常見的急性胰腺炎急重癥，病死率較高，嚴(yán)重威脅病人的生命安全［4］。Toll樣受體是體內(nèi)固有免疫蛋白分子，主要介導(dǎo)機(jī)體感染免疫反應(yīng)的亞型為Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體2（TLR4），其作為連接固有免疫反應(yīng)和適應(yīng)免疫反應(yīng)的橋梁，在肝損傷發(fā)生進(jìn)展機(jī)制中起著重要作用［5-7］。本研究旨在從TLR2、TLR4等分子水平為AHNP合并肝損傷的臨床診斷提供依據(jù)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2019年6月至12月選取健康SD大鼠（鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）60只，體質(zhì)量200～240 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由攝食和飲水，晝夜交替12 h，室溫20～24℃，濕度50%～60%，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和對(duì)照組，每組30只，同時(shí)模型組和對(duì)照組再隨機(jī)分為3 h組、6 h組和12 h組，每組10只。在實(shí)驗(yàn)過程中無(wú)大鼠自行死亡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1模型制備參照文獻(xiàn)報(bào)道［8］利用牛磺膽酸鈉建立AHNP肝損傷模型，具體方法為：嚴(yán)格禁食、自由飲水超過12 h后常規(guī)進(jìn)行開腹手術(shù)，腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（4 mL∕kg）進(jìn)行麻醉，待麻醉起效后，在腹部正中作一切口，切開皮膚、皮下組織以常規(guī)進(jìn)腹，探查腹腔找到胰膽管，利用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉近肝門處的膽總管，之后將濃度為4.5%的牛磺膽酸鈉溶液勻速推注到胰膽管中，推注速度為0.1 mL∕min。對(duì)照組僅接受開腹手術(shù)，注射生理鹽水。

1.2.2血清測(cè)定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、淀粉酶的檢測(cè)：采用可見分光光度計(jì)比色法測(cè)定進(jìn)行，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

1.2.3組織學(xué)觀察（1）用二甲苯將石蠟切片透明5 min，并泡2次；依次用100%，95%，75%，50%的乙醇梯度復(fù)水，每次浸泡2 min，最后用自來水沖洗。（2）檸檬酸高壓1.5 min以修復(fù)組織。（3）PBS沖洗3次，每次3～5 min。除去PBS液，向每張切片中加50 μL 3%過氧化氫將內(nèi)源性過氧化物加以阻斷，并在室溫條件下孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min，除去PBS液。（4）50 μL非免疫山羊血清分別滴加至每張切片，室溫下孵育10 min，直接甩去血清。（5）均向每張切片中加入50 μL的第一抗體，置于室溫條件下孵育60 min。PBS沖洗3次，每次3～5min。除去PBS液，再加入50 μL即用型MaxVision試劑，室溫下孵育15 min。（6）PBS沖洗3次，每次3 min。（7）除去PBS液，加100 μL DAB顯色液（新配制），作用5 min，顯微鏡下觀察。（8）自來水沖洗，并用蘇木素復(fù)染，自來水沖洗后返藍(lán)，濃度梯度酒精以脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。（9）鏡下閱片、攝像。

1.2.4TLR2、TLR4信使核糖核酸（mRNA）的qRT-PCR檢測(cè)用Trizol（Invitrogen公司）抽提RNA后，采用RTPCR法檢測(cè)TLR2、TLR4mRNA，TLR2mRNA引物序列：正向5′-GGCATCTGCTGTCGTCTCTT-3′，反 向5′-GCATAGCTGGCGTACGATTT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度492bp。TLR4 mRNA引物序列：正向5′-TGGATACGTTTC-CTTATAAG-3′，反向5′-GAAATGGAGGCACCCCT-TC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度508 bp。內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白序列：正向5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3′，反向5′-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度250 bp。RT反應(yīng)條件：30℃反應(yīng)10 min；50℃、3 0min滅活轉(zhuǎn)錄酶；99℃、5 min。TLR2、TLR4mRNA擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性1min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；72℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物在20 g∕L的瓊脂糖凝膠中電泳，加樣量為5 μL。分析PCR產(chǎn)物，測(cè)定擴(kuò)增帶（目的條帶和β-actin）的吸收度值，計(jì)算TLR2、TLR4mRNA與β-肌動(dòng)蛋白的吸光度比值。

1.2.5Western blotting檢測(cè)蛋白裂解液裂解100 mg肝組織，超聲勻漿后，4℃離心10 min取上層清液，添加等體積SDS buffer緩沖液，95℃水浴中煮5 min后立即冰浴，取出再次離心10 min并集取上清液進(jìn)行SDSPAGE電泳（80 V恒壓下于5%濃縮膠中45 min后，再置于120 V恒壓、12%分離膠中留置180 min），電泳產(chǎn)物放置于聚偏二氟乙烯膜上活化（甲醇泡2 min后用蒸餾水泡1 min，再放置到緩沖液中泡3 min）。在轉(zhuǎn)移儀上完成轉(zhuǎn)膜（條件為200 mA恒流下作用120 min），添加牛血清白蛋白溶液，置于4℃環(huán)境中封閉過夜。次日取出分別添加一抗（即TLR2和TLR4），4℃下過夜孵育，對(duì)照品：鼠源β-actin抗體（1∶1 000一抗稀釋），所用溶液是洗膜緩沖液。取出后再添加二抗在室溫下孵育（稀釋比例為1∶10 000）120 min，添加電化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色顯影、定影和拍照，將圖像上傳至Photoshop 7.0分析系統(tǒng)中，分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，淀粉酶、ALT等資料比較采用±s表示，兩組間比較使用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析及兩兩比較的LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清AST、ALT及淀粉酶比較隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，ALT、AST和淀粉酶逐漸增高。模型組造模后3 h組、6 h組和12 h組血清ALT、AST和淀粉酶均明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。見表1。

表1 兩組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及淀粉酶比較∕（U∕L，±s）

表1 兩組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及淀粉酶比較∕（U∕L，±s）

注：①與3 h比較，均P＜0.001。②與6h比較，均P＜0.001。

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2.2 兩組肝組織TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝臟組織TLR2和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增高。模型組造模后3 h、6 h和12 h肝臟組織TLR2和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.001）。見表2。

表2 兩組肝臟組織TLR2和TLR4 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 兩組肝組織TLR2、TLR4蛋白表達(dá)隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝臟組織TLR2和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸增高。模型組造模后3 h、6 h和12 h肝臟組織TLR2和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。見表3。

表3 兩組肝臟組織TLR2和TLR4蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 各組肝組織觀察對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝細(xì)胞形態(tài)正常，模型組造模后3 h組可見肝細(xì)胞氣球樣變性，6 h組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)匯管區(qū)，小葉周邊細(xì)胞發(fā)生嗜酸性變性，12 h組肝小葉出現(xiàn)大片狀出血壞死及灶性壞死。

2.5 相關(guān)性分析將大鼠肝組織TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)與血清ALT、AST和淀粉酶進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：肝組織TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)與血清ALT、AST和淀粉酶呈正相關(guān)（r=0.31、0.32、0.30，均P＜0.05），TLR2、TLR4蛋白表達(dá)與血清ALT、AST和淀粉酶呈正相關(guān)（r=0.34、0.33、0.32，均P＜0.05）。

3 討論

急性胰腺炎是由于胰腺酶過度激活導(dǎo)致胰腺自身及周圍臟器具有消化作用而臨床癥狀表現(xiàn)為炎癥浸潤(rùn)的常見急腹癥之一。根據(jù)病理特點(diǎn)臨床上將急性胰腺炎分為急性水腫性胰腺炎和急性出血壞死性胰腺炎（AHNP）［9］。前者病情輕，起病緩慢，可通過胰腺休息療法和液體療法等內(nèi)科保守治療［10］。后者起病急，病情兇險(xiǎn)且疾病進(jìn)展快，病情復(fù)雜多樣，合并多種臟器功能障礙或衰竭，死亡率高，是目前外科急腹癥手術(shù)中最棘手的問題［11］。AHNP發(fā)病原因復(fù)雜，包括暴飲暴食飲食因素、膽汁反流、十二指腸液反流、酒精中毒、高脂血癥、手術(shù)創(chuàng)傷、感染、妊娠、高鈣血癥等在內(nèi)的內(nèi)分泌和代謝因素等。目前認(rèn)為胰腺酶過早激活是AHNP疾病發(fā)生進(jìn)展的重要因素。過度激活的胰腺酶使胰腺本身胰腺腺泡溶解，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞分泌大量包括腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）等在內(nèi)的細(xì)胞因子，同時(shí)誘導(dǎo)粒細(xì)胞分泌更多的溶酶體和炎癥介質(zhì)，維持并放大炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為瀑布式級(jí)聯(lián)反應(yīng)，臨床表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。同時(shí)，腸道菌群失衡進(jìn)一步刺激單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)和內(nèi)毒素，對(duì)機(jī)體造成二次損傷，誘發(fā)多臟器功能不全或衰竭。其中肝臟是胰腺血液回流的第一站，且作為單核巨噬細(xì)胞密集地，是細(xì)胞因子產(chǎn)生、滅活的主要靶器官之一［12-13］。故成為AP胰臟外主要累及器官。

有資料顯示40.1%～56.6%的AHNP并發(fā)肝損傷［14］。目前雖然已清楚掌握AHNP相關(guān)性全身炎癥反應(yīng)等下游事件，但對(duì)于炎性因子釋放、活化的上游信號(hào)通路尚不清楚。故研究誘發(fā)ANHP炎癥活化并釋放的上游信號(hào)通路機(jī)制對(duì)AHNP肝損傷的預(yù)防和治療至關(guān)重要。Toll樣受體（TLR）有多種亞型，其中TLR2、TLR4是與感染免疫相關(guān)的主要受體，具有廣譜識(shí)別能力的模式識(shí)別受體（PAMP）介導(dǎo)細(xì)菌、病毒、螺旋體細(xì)胞壁成分等致病因子的跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，觸發(fā)全身炎癥反應(yīng)，在機(jī)體抗炎免疫反應(yīng)過程中起著重要作用。有研究報(bào)道TLRs介導(dǎo)通過激活TLR→NF-kB信號(hào)途徑誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程，是機(jī)體多臟器損傷的重要原因［15］。近年來，有多項(xiàng)研究表明TLRs水平與急性胰腺炎的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)系［16］。本研究結(jié)果顯示，AHNP肝損傷組較對(duì)照組血清ALT、AST、淀粉酶、TLR2、TLR4 mRNA水平顯著升高。其中ALT、AST是臨床常見的肝功能反應(yīng)指標(biāo)［17］，其水平超過正常范圍可反映肝功能損傷程度。以上研究結(jié)果與既往研究報(bào)道一致［18-19］。說明TLRs受體在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)相關(guān)的AHNP肝損傷發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。同時(shí)，本研究結(jié)果顯示，TLR2、TLR4 mRNA水平與ALT、AST、淀粉酶水平呈正相關(guān)，提示以上血清學(xué)指標(biāo)檢查結(jié)果的一致性可提高AHNP合并肝損傷的確診正確率。另外，本研究通過AHNP造模成功后時(shí)間段的不同觀察肝組織病理性改變發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間推移肝組織可由部分細(xì)胞變性逐步進(jìn)展為大面積片狀出血壞死，病理切片特征顯著。提示，可結(jié)合病理學(xué)檢查評(píng)估肝損傷程度和疾病進(jìn)展情況。

綜上所述，TLR2、TLR4 mRNA和蛋白在AHNP肝損傷中的表達(dá)升高，可能在肝臟損傷過程中有重要作用。本研究創(chuàng)新處，從分子機(jī)制確定TLR2、TLR4 mRNA在AHNP合并肝損傷中的診斷價(jià)值，為其臨床診治和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)有效的指標(biāo)，具有重要的臨床指導(dǎo)意義。