稽留流產絨毛染色體通量測序技術檢測235例結果分析

張羽，劉琰，李蘭蘭，李麗

稽留流產（missed abortion，MA）指胚胎或胎兒死亡后滯留于宮腔未能及時排出的一種流產類型［1］。其病因復雜多樣，包括染色體、內分泌、感染、免疫、解剖等因素的影響，且仍有50%病因不明。在不明原因自然流產中，染色體異?？蛇_50%～85%［2］。本研究回顧性分析我院稽留流產病人絨毛染色體基因拷貝數檢測（genomic copy number variations，CNVs）及核型分析結果，進一步明確流產病因，從而更好地做出遺傳學咨詢、改善妊娠結局。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2018年8月至2019年8月西北婦女兒童醫院生殖婦科稽留流產病人235例。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。其納入標準：年齡范圍20～45歲，孕齡7～12周，此次妊娠經B超動態監測為空孕囊或未見胎心搏動或胎心搏動消失者診斷為稽留流產，且妊娠期間無感染，無放射線、毒物接觸史，無生殖系統結構異常，無高血壓、糖尿病等內外科合并癥。所有病人簽署知情同意書。

1.2 研究方法稽留流產病人流產后收集絨毛組織10 mg，用生理鹽水沖洗殘留血液、剔除其他組織。采用Qiagen Blood & Tissue（德 國Qiagen GmbH）進行絨毛DNA提取，隨后進行文庫制備（EZGALO），最后采用高通量測序儀（NextSeq CN 500）進行測序。最后，將所測結果與人類基因組數據庫進行匹配比較。

1.3 統計學方法應用SPSS 18.0進行統計學分析。計量資料采用±s表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 絨毛高通量測序染色體檢測結果235例稽留流產病人絨毛染色體檢測結果中，有70例（29.79%）結果正常，165例（70.21%）存在異常現象。其中染色體數目異常有118例（71.5%），染色體結構異常有47例（24.48%）（表1）。

表1 稽留流產病人235例絨毛染色體檢測結果∕%

2.1.1染色體數目異常結果在染色體數目異常中（n=118），以非整倍體為主，其中三體所占比例最高——46.7%（n=77），以16、22、21、15-三體最為高發。而所有的雙重三體均為21或22-三體合并其他三體（表2）。性染色體非整倍體包含1例三體（47，XN，+X）及7例單體（均為45，X）。嵌合體包含三體嵌合體、單體嵌合體、兩性嵌合體，其中三體嵌合體可見不等數量的3、17、18、20-三體。在235例病人中，除了1、19-三體未發現，其余編號染色體均可見三體存在。

表2 6例染色體雙重三體詳情

2.1.2染色體結構異常結果47例染色體結構異常的位點不同、拷貝數大小不等，導致其致病性不同。經查詢對比DGV、DECIPHER、OMIM、UCSC以及PubMed公共數據庫資源可得，未知致病性占55.32%（n=26）、多態性占25.53 %（n=12）與已知致病性19.15%（n=12），其中已知致病詳情見表3。

表3 已知致病性染色體結構異常病人9例詳情

所有未知致病性的異?？截悢捣秶鸀?.12～3.64 Mb，多態性為0.28～1.06 Mb，已知致病性為0.24～99.42 Mb。

2.2 染色體異常與病人年齡、妊娠方式及流產次數的關系與三體組年齡（32.55±4.65）相比，雙重三 體 組 年 齡（38.67±3.14）明 顯 偏 高（t=4.41，P＜0.05）。而染色體正常組年齡較異常組偏低（P＜0.05），且年齡＜35歲組染色體異常發生率明顯低于年齡≥35歲組（P＜0.05）；染色體的異常率與病人妊娠方式及既往流產次數無關（P＞0.05）。見表4。

表4 稽留流產235例絨毛染色體異常相關因素分析

3 討論

稽留流產發病率高，且病因不明、復雜多樣［3］，檢測稽留流產病人染色體異常情況，有助于尋找流產原因，最終緩解病人及其家庭身心壓力［4］。

有數據報道，早期流產中胚胎染色體異常率可達50%～60%［5-8］。常規的G帶核型分析被用作檢測染色體非整倍性和不平衡的金標準，但此方法失敗率較高、易受母體細胞污染、只能檢測特定的染色體異常［9］，可造成結果偏差［10］。而高通量測序技術作為第二代測序的代表，擁有高通量、高精準、低成本、易操作等優勢［11］，因而應用廣泛。并且范寶光等［12］指出，高通量基因測序技術能發現稽留流產絨毛染色體的微缺失或重復，為檢測染色體結構異常開辟了新的途徑，有望成為稽留流產絨毛染色體檢測的主要手段。

本研究正是采用高通量測序技術檢測235例稽留流產病人絨毛染色體異常情況及基因拷貝數，最終可得染色體異常率為70.21%，與Jurkovic D等［2］報道相近。

染色體異常包括數目與結構的異常，其中以染色體數目異常為主［13］。本研究結果中，染色體數目異常占71.5%（包括雙重三體及嵌合體），其中非整倍體可達染色體異常的54.55%。有文獻表明，大多數非整倍體的發生是因為卵母細胞第一次減數分裂錯誤所致［3］。而非整倍體改變中以染色體三體為主，并以16-三體出現頻次最高。與本研究一致：16-三體所占比例最高（33.77%），緊隨其后的有22-三體（19.48%）、21-三體（15.58%）、15-三體（5.19%）。但與大多數非整倍體發生原因不同的是，16-三體的發生可能與父系第一次減數分裂未分離關系更加密切［14］。雖然16-三體在早期流產中所占比例極高，但并不能完全說明16-三體是導致流產的主要因素。因其他染色體的異?？赡軙苯訉е屡咛ゲ恢捕档蜋z出率，或其異常染色體并不致死，可持續至孕中、晚期。此外，本研究所出現的77例三體中，除了1、19號染色體未發現三體外，其余編號染色體均存在染色體三體現象［15］，且大部分文獻均未見1-三體報道［16］。

本研究所有嵌合體占異?？倲档?6.9%，且嵌合類型不一。其中7例單體均為45，X（Turner綜合征），占非整倍體的7.8%。Turner綜合征在新生女嬰中發病率約達1∕5 000，臨床病例多見，常表現為身材矮小、性腺發育不良［17］。由于正常與異常細胞系比例不定，此結果不一定反映真實水平。

染色體結構異常包括重復、缺失、異位、倒位、插入等，本研究中數目異常與重復、缺失、重復與缺失并存。因高通量測序技術準確率、靈敏度均較高，可檢測100 kb以上片段大小。此235例樣本中發現了0.12～99.42 Mb大小不等的異常片段，擁有較高的染色體異常檢出率，增加了診斷的準確性。如上所述，基因異常的位點及大小不同，導致的致病性亦不同；但未知致病性及多態性的異常片段相對較小，易于得到基因補償而無臨床特殊癥狀表現。

年齡是影響妊娠的一大重要因素，年齡越大、流產率越高［18］。女性隨著年齡的增長，卵子質量會相應下降，且高齡會增加染色體不分離現象，從而導致非整倍體的發生。本研究進一步證明，染色體異常組病人年齡（32.08±4.52）明顯高于正常組（30.19±3.62），且 年 齡≥35歲 組 染 色 體 異 常 率（83.92%）較正常組（65.92%）偏高。而表2顯示，雙重三體病人的年齡（38.5±3.27）異常偏高，考慮高齡更易導致雙重三體的發生。而妊娠方式與染色體異常率并無相關關系，這與一項Meta分析結果相一致［19］。且本研究表明流產次數與染色體的異常率亦無明顯必然聯系。雖在6例雙重三體中，除了1例病人為自然妊娠，其余均為人類輔助生殖技術助孕，分析其原因可能為樣本數較小，且病人有不孕史、年齡偏大，因此采取了人類輔助生殖技術。

綜上所述，早期流產的主要原因仍以胚胎染色體異常為主。高齡可增加胚胎染色體的異常風險，但妊娠方式及既往流產次數對胚胎染色體并無明顯影響。高通量測序技術可準確、快速地檢出染色體異常率及異常情況。