花生四烯酸12-脂氧化酶-12-氫基二十碳四烯酸-GPR31軸在肝臟再灌注肝缺血損傷中的作用

2022-01-04 08:09:56高楊張升寧李來邦冉江華

安徽醫藥 2022年1期

高楊，張升寧，李來邦，冉江華

隨著移植科學的快速發展，器官移植已成為器質性終末期病人唯一決定性且有效的治療手段［1］。其中，移植組織的缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion，IR）是器官移植中不可避免的后果［2］。IR相關的組織損傷占早期移植失敗的10%，是導致器官排斥和肝功能損害的主要原因［3］。不僅是器官移植手術，肝臟再灌注肝缺血損傷多發于缺血性休克及多種肝臟外科手術中，是影響肝移植和肝臟葉段切除術后肝功能的一個多因素過程［4］。肝臟組織長時間缺血會產生由活性氧簇產生、中性粒細胞活化等導致炎癥、細胞凋亡和損傷過程［5］。再灌注后，會進一步加重肝臟組織細胞的代謝障礙和結構破壞。組織損傷進一步加重，甚至導致肝臟的功能衰竭，嚴重威脅了病人生命［6］。目前為止，還沒有有效的藥物干預治療肝IR損傷，缺血預處理是唯一有希望的改善預后的策略［7］。然而，預處理的有益效果僅限于一部分年輕病人，例如能夠實現長時間的血流阻斷且肝臟體積較?。?］。由于肝臟缺血損傷的致病模式涉及缺血誘導的細胞損傷和再灌注引起的炎癥反應的雙相過程［9］。因此，對于肝臟再灌注肝缺血損傷，需要開發有直接抗炎和抗凋亡兩種特性的藥物，目前并未發現能夠有效實現這種臨床作用的有效藥物［10］。因此，需要更深入的了解這種致病過程的基本機制。本研究自2019年2―6月采用肝臟再灌注肝缺血損傷小鼠模型，通過基因敲除手段阻斷12-氫基二十碳四烯酸（HETE），觀察其對肝臟再灌注肝缺血損傷中的改善作用。從而為花生四烯酸12-脂氧化酶（ALOX12）-12-HETE-GPR31軸在肝臟再灌注肝缺血損傷臨床治療中的臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 小鼠模型構建8周齡雄性B6.Cg-Tg（MX1-cre）Cgn∕J小鼠（Joint Ventures Sipper BK）36只，體質量（23±3）g，購自昆明市第一人民醫院動物實驗室。實驗中充分保證動物福利、給予動物人道關懷，動物處置也符合倫理學原則。小鼠采用隨機數字表法分為空白對照組、實驗對照組和實驗組，每組各12只。所有小鼠禁食12 h后，采用5 mL∕kg的25%（V∕V）烏拉坦進行腹腔注射麻醉。（1）實驗組：小鼠進行基于胚胎干細胞的基因打靶技術制備基因敲除手術：①訂購課題BAC菌；②完成打靶載體設計和構建；③將重組載體電轉到胚胎干細胞中，用G418篩選轉染后的胚胎干細胞得到陽性克??；④通過PCR和southern blot雜交技術篩選陽性克隆，得到穩定整合外源基因的胚胎干細胞；⑤將胚胎干細胞陽性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宮內；⑥獲得F1陽性雜合子小鼠。進行肝血流阻斷。肝血流阻斷45 min后發送移走血管夾，以恢復血液供應。（2）實驗對照組：進行肝血流阻斷。（3）空白對照組：同樣進行開腹但并不進行肝血流阻斷。

1.2 實時熒光定量PCR（RT-PCR）采用Trizol抽提法提取采集小鼠組織的總RNA，然后按照反轉錄試劑盒（TAKARA公司）說明書合成cDNA。隨后進行實時熒光定量PCR，RT-PCR方法參照TAKARA公司的SybergreenI mix試劑盒。RT-PCR反應體系為20 μL，其中2×賽柏格林（Sybergreen）預混液10 μL，校正染料0.3 μL，cDNA 1.5 μL，上下游引物各0.5 μL，加水至20 μL。采用ABI公司的7300型Real-Time PCR儀進行RT-PCR，反應條件為：94℃5 min，94℃15 s，58℃15 s，72℃15 s，共35個循環，擴增反應完成后又進行了溶解曲線的制作，確保擴增的特異性。

1.3 炎性因子水平和12-HETE積累檢測采用ELISA法分別檢測肝臟血清中白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNFα）三項炎性因子水平和12-HETE積累。檢測均按照試劑盒檢測方法進行，試劑盒均購自南京建成科技有限公司。

1.4 采用蛋白質印跡法（Western blotting）檢測ALOX12-12-HETE-GPR31軸中基因編碼蛋白表達水平勻漿器裂解組織，置于冰上冷卻30 min后，采用離心機13 000 r∕min離心10 min，取上清。上清移至96孔板中，然后采用BCA法進行蛋白濃度的測定。采用SDS變性蛋白質電泳法檢測蛋白表達水平。采用9%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白。三明治法正確放置凝膠和PVDF，70 V電壓轉移3～4 h［11］。取出后，將PVDF膜浸入封閉液中，37℃平緩搖動1 h。取出后，將PVDF膜浸入雜交袋中，袋中含5 mL相應I抗，4℃平緩搖動過夜。取出后采用TBS∕T漂洗干凈，然后浸入含5 mLⅡ抗的雜交袋中，37℃平緩搖動1 h。再經TBS∕T充分漂洗后，ECL化學發光及膠片曝光對比結果。

1.5 細胞凋亡率的測定采用原位細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡情況。采用4%多聚甲醛固定1 h后，使用3%過氧化氫溶液和預冷處理的蛋白酶K處理，然后于37℃濕盒dUTP標記2 h。SABC鏈霉親和素-過氧化物酶結合，DAB顯色。染色后，細胞核呈棕黃色的細胞被判為凋亡細胞。凋亡指數為（凋亡細胞數∕總細胞數）×100%。

1.6 肝功能指標檢測清晨用真空管取空腹靜脈血，分離血清，采用日立7180全自動生化分析儀檢測肝功能各項指標，試劑由上海科華生物技術有限公司提供。肝功能檢查指標：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、AST∕ALT。

1.7 統計學方法本研究采用SPSS 20.0統計軟件（美國IBM公司）處理；計量資料采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩組比較采用LSD-t檢驗；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠ALOX12、12-HETE和GPR31基因編碼蛋白表達量比較空白對照組小鼠再灌注后1 h、3 h和6 h的ALOX12基因表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。而實驗對照組，即肝臟再灌注肝缺血損傷小鼠的ALOX12基因在不同再灌注時間的表達量高于空白對照組小鼠（P＜0.05），且隨著灌注時間的延長而逐漸增大（P＜0.05）。ALOX12基因敲除的實驗組小鼠，ALOX12基因表達量再灌注后1 h、3 h和6 h降低（P＜0.05），與空白對照組基因表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖1。