高效液相色譜雙波長法同時測定復方枇杷噴托維林顆粒中三種成分

任靜，杜暉

復方枇杷噴托維林顆粒是由枇杷葉流浸膏、甘草流浸膏和枸櫞酸噴托維林等按一定比例制成，可用于上呼吸道感染、支氣管炎等引起的干咳或咳嗽少痰。枸櫞酸噴托維林是制劑中的化學藥組分，它是一種非成癮性中樞鎮咳藥，實驗中多采用HPLC法測定其含量［1］。甘草酸是甘草流浸膏中最主要的活性成分，包括其二銨鹽、苷類具有抗炎［2-4］、抗病毒［5-7］、抗動脈粥樣硬化［8-9］及抑制肝損傷［10-14］等藥理作用；而甘草次酸是甘草酸在體內的代謝產物，具有肝臟保護［15-16］和抗氧化作用［17］。有報道表明甘草酸及其代謝產物是中藥制劑發揮鎮咳功效的“使藥”成分之一［18］，所以兩者的含量與制劑的藥理活性緊密相關。該藥品現行標準中采用紫外分光光度法測定制劑中枸櫞酸噴托維林的含量，方法需要經甲基橙顯色氯仿提取，重現性較差［19-20］；有文獻對其中枸櫞酸噴托維林和甘草酸分別進行含量測定［20-21］，但因采用兩種完全不同的色譜體系導致測定煩瑣，也無甘草酸代謝產物甘草次酸的含量控制項目。因此，建立一種能夠同時測定多種成分含量的方法尤為重要。本研究采用HPLC雙波長法梯度洗脫快速測定復方枇杷噴托維林顆粒中枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸三種成分的含量，為該制劑質量標準的完善和提高提供參考。本研究起止時間為2019年6月至2020年5月，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥熱電Ultimate 3000高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Milli-Q Advantage超純水機（美國密理博公司）；MS105十萬分之一天平（瑞士梅特勒公司）。

復方枇杷噴托維林顆粒（江西贛南海欣藥業股份有限公司，批號15121001、15121002、15012203）；甘草酸銨（批號110731～201720，含量97.7%）、甘草次酸（批號110723～201715，含量99.6%）和枸櫞酸噴托維林（批號100432～201803，含量99.8%）等對照品均來自中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇來自美國霍尼韋爾公司；實驗用水由Milli-Q系統制備。

1.2 方法

1.2.1 溶液的制備

1.2.1.1 樣品溶液的制備取10袋顆粒混合，研細，稱取適量（約10.000 g），置100 mL量瓶中，加50 mL水振搖使溶解，再用甲醇定容，濾過，取續濾液經0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

1.2.1.2 混合對照品溶液的制備精密稱取甘草次酸對照品10.09 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度；精密稱取枸櫞酸噴托維林對照品20.52 mg和甘草酸銨對照品10.02 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，精密加入甘草次酸對照品溶液2 mL，用甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品儲備溶液。分別精密量取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、2 mL、4 mL和10 mL，置20 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即為混合對照品溶液。

1.2.2 色譜條件熱電ScientificTMAcclaimTM120? C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A為甲醇，B為1%三乙胺水溶液（用磷酸調pH為3.0），二元梯度洗脫（0～5 min，60%A；5～20 min，A相線性上升至90%；20～25 min，90%A；25.1～30 min，60%A）；流速1.0 mL∕min；柱溫30℃；進樣量10 μL；DAD檢測（波長設置為215 nm和250 nm）。

2 結果

2.1 線性關系考察精密量取“1.2.1.2”項下配制的枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的混合對照品溶液，分別注入色譜儀，以主成分峰面積Y（mAU·min）對濃度X（μg∕mL）進行線性回歸，相關系數（r）均大于0.999 9，見表1。

表1 三種組分的回歸方程、相關系數和線性范圍

2.2 專屬性及樣品含量測定分別吸取混合對照品、批號為15012203的供試品和陰性樣品溶液10 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖如圖1所示，枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的保留時間分別為6.5 min、14.1 min和23.3 min，三種成分與雜質之間分離良好。

圖1 HPLC色譜圖

按“1.2.2”項色譜條件測定三批復方枇杷噴托維林顆粒中三種組分的含量，如表2所示，枸櫞酸噴托維林和甘草酸的含量與處方量和文獻值基本一致［20-21］。其中甘草酸含量較之甘草流浸膏中甘草酸限值略低［22］，可能是顆粒長時間存放或運輸途中發生了變化。

表2 樣品測定結果

2.3 精密度考察將批號為15012203的樣品溶液連續進樣6次，發現枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸峰面積的RSD值分別為0.60%、0.59%和0.38%，證明儀器精密度能滿足實驗要求。

平行處理6份批號為15012203的樣品，按2.2項色譜條件測定樣品中枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的含量，RSD值分別為0.68%、0.25%和0.79%，方法重復性良好。

為了考察不同人員和儀器對精密度的影響，重新配制混合對照品溶液并處理6份批號為15012203的樣品，測得樣品中枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的平均含量分別為1.88 mg∕g，0.80 mg∕g和9.18 μg∕g，對 應 的RSD分 別 為1.25%、0.52%和0.91%。結果顯示，枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的F值分別為3.21、4.02和1.32，均小于置信度為95%時的F（5，5）值（5.05），說明兩組精密度結果差異無統計學意義。

2.4 穩定性考察將上述溶液保存在4℃環境中，并在6 h、12 h、24 h和48 h后進樣分析，三種組分含量的RSD值分別為1.51%、0.89%和2.02%，說明樣品溶液在2 d內保持穩定。

2.5 回收率考察精密稱取甘草次酸對照品4.52 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，作為甘草次酸溶液。精密稱取枸櫞酸噴托維林對照品101.70 mg和甘草酸銨對照品41.45 mg，置同一10 mL量瓶中，用上述溶液溶解并稀釋至刻度。精密稱取批號為15012203的樣品約5.00 g，置100 mL量瓶中，平行9份，分別精密加入上述混合對照品溶液0.50 mL、1.00 mL和1.50 mL，每組平行3份，按“1.2.1.1”項下方法對樣品進行處理，計算平均回收率，枸櫞酸噴托維林、甘草酸和甘草次酸的平均回收率分別為102.27%，99.94%和98.02%，相應的RSD為2.31%，2.33%和2.42%，結果如表3所示。

表3 三種組分的回收率

3 討論

檢測波長的選擇：枸櫞酸噴托維林的最大吸收波長為200 nm，而甘草酸和甘草次酸的最大吸收為250 nm。甲醇的紫外吸收波長為205 nm，在此范圍內測定基線不平穩，干擾較明顯；但波長大于215 nm，噴托維林的紫外吸收又明顯減弱。綜合考慮，我們設置為雙波長215 nm和250 nm同時檢測。

提取溶劑的選擇：比較了相同的超聲時間下，甲醇、甲醇-水（50∶50）和水等三種溶劑的提取率和樣品出峰情況。試驗發現，甲醇的提取率最低，而顆粒在水中的溶解性最好；但溶劑與流動相極性差別較大導致目標物的色譜峰延展嚴重。故我們在水提物中加入相同比例的甲醇，從而滿足我們的分析要求。

流動相的選擇：本組嘗試采用乙腈-水（60∶40）和甲醇-水（70∶30）等度洗脫，發現甘草酸和甘草次酸的出峰時間較晚，且色譜峰有拖尾現象，故在水相中加入1%的三乙胺用以改善峰形。我們發現噴托維林和甘草酸的色譜峰在乙腈體系中較之甲醇寬，塔板數略低；另外藥典中對噴托維林的測定亦采用甲醇-水體系［23］。但是提高甲醇比例，枸櫞酸噴托維林又與相鄰雜質峰無法基線分離。最后我們降低初始狀態下有機相比例，采用甲醇-1%三乙胺水溶液（用磷酸調pH為3.0）梯度洗脫，分離度和重現性較好。

現行標準中采用甲基橙分光光度法測定噴托維林的含量，且缺乏甘草酸和甘草次酸等成分的測定項目，所以標準的專屬性和全面性存在較大缺陷。本研究采用HPLC雙波長法梯度洗脫同時對顆粒中三種組分進行分離測定，簡化了文獻中2個色譜體系才能完成的檢驗任務，大大縮短了分析時間，為該制劑質量標準的完善和提高提供了參考。