銅綠假單胞菌群體感應系統調控生物膜形成及應對策略研究進展*

趙方建，劉 唯 綜述，陳 鍵審校

湖南師范大學附屬第一醫院/湖南省人民醫院檢驗二部，湖南長沙 410000

銅綠假單胞菌(PA)是一種革蘭陰性的條件致病菌，同時也是常見的醫院內感染菌，在2020年中國細菌耐藥監測研究中位于非發酵菌分離率首位[1]。其產生的外毒素、彈性蛋白酶、綠膿素等多種致病產物，可引起包括呼吸系統、循環系統、皮膚傷口和手術切口在內的多方式多部位的感染，在兒童重癥血流感染中病死率甚至可達到76%[2]。研究表明PA可通過形成生物膜逃避宿主免疫系統的清除和抗菌藥物的殺傷，生物膜中細菌抗性甚至比浮游菌高1 000倍[3]，而群體感應(QS)系統是調控PA生物膜形成和毒力因子產生的最重要的因素之一，QS系統相關基因的表達，直接或間接導致了細菌生物膜的形成和毒力增強。近年來各類廣譜抗菌藥物及導管、內鏡等侵入性操作的大量應用，更是加重了這一效應，因此對銅綠假單胞菌群體感應(PA-QS)系統調控生物膜的進一步研究尤為必要，本文就QS系統調控PA生物膜形成的機制，綜合國內外相關課題研究工作和成果，尋找更多可能的應對策略，為臨床治療PA感染提供理論依據。

1 QS系統

1.1QS系統的定義 QS系統廣泛存在于各類細菌中，PA-QS系統調控生物膜形成則是在1998年由DAVIES等[3]首次報道，發現LasI-RhlI雙突變體PA菌株生物膜厚度僅為野生型菌株的20%，野生型菌株生物膜為成熟的蘑菇狀，而突變型菌株生物膜為片狀且不連續[3]。PA-QS系統主要通過細菌生長過程中分泌自體誘導分子(AI)實現，細菌將此類信號分子分泌至胞外環境中，當細菌繁殖到一定密度，信號分子積聚到一定的閾值時可激發細菌QS系統相關基因的表達和正反饋通路，誘導細菌對特定環境條件作出反應，包括群集運動、毒力基因的表達、形成生物膜，進而導致細菌侵襲性、耐藥性、免疫逃逸性的增強。

1.2QS系統的組成 QS系統已知主要由Las系統、Rh1系統和喹諾酮信號系統這3種子系統組成，研究表明3種子系統存在級聯調控，其中Las系統處于系統調節的上游位置，是整個QS系統的主控因子，Las系統由LasI基因與受體蛋白LasR組成，LasI指導酰基高絲氨酸內酯(AHL)分子N-3-氧代-十二烷酰基-高絲氨酸內酯的合成，AHL與受體蛋白LasR結合形成轉錄調節復合物，激活LasI基因自身相關毒力因子包括LasA蛋白酶、LasB彈性蛋白酶、堿性磷酸酶等下游靶基因的表達。另一方面，與Las系統類似，Rh1系統由RhlI基因和受體蛋白Rh1R兩部分組成，RhlI指導合成信號分子N-丁酰基高絲氨酸內酯(C4-HSL)，C4-HSL則與轉錄調節因子Rh1R結合作為轉錄調節復合物，參與調控Rh1AB等相關基因表達，指導鼠李糖脂、氰化物、綠膿菌素的合成[4]。而喹諾酮系統是由信號分子2-庚基-3-羥基-4-喹諾酮(PQS)和其受體蛋白PqsR組成，先是由MvfR作為轉錄調節因子激活操縱子PqsABCDE基因的轉錄，其轉錄產物指導合成PQS的直接前體4-羥基-2-庚基-喹諾酮(HHQ)，HHQ通過單加氧酶催化成為PQS，繼而與PqsR結合形成轉錄調節復合物，指導綠膿菌素等毒力因子的表達。其中MvfR和單加氧酶的操縱子均受上游Las系統的正向調控，同時PqsABCDE基因轉錄產生操縱子PqsE，而PqsE可以激活Rh1系統的表達，故可視喹諾酮系統為Las系統與Rh1系統的橋梁，其直接受Las系統、Rh1系統的調控，同時又調控著Rh1系統[5-6]。隨著研究深入，越來越多新的子系統和調控旁路被發現，例如一種新的IQS系統子系統，其AI結構為2-(2-羥基苯基)-噻唑-4-碳醛。在缺乏磷酸鹽的環境下IQS系統可以替代部分Las系統的功能，接管喹諾酮系統和Rh1系統的表達，其可以將QS系統與環境應激反應結合起來調節下游基因的表達[7]。由此可以得知，QS系統的幾個子系統相互交織，控制著數百個靶基因的表達，也受多個信號旁路調控。同時Las系統的失活不一定會造成毒力因子表達的癱瘓，這為研究提供了新的思路，那就是Rh1系統及喹諾酮系統同樣在QS系統中同樣扮演重要角色，需從QS系統全局出發尋找更多群感抑制的替代方案。

2 生物膜

2.1生物膜的形成 PA生物膜的形成是一個動態過程，初期是由浮游細菌黏附在宿主或物體表面形成微菌落狀態，細菌通過Ⅳ型菌毛的蹭行運動聚集形成群落狀態，其中細菌的黏附、群集及Ⅳ型菌毛均受Las/Rh1系統基因的調控。群落狀態的細菌產生并分泌胞外多聚物(EPS)，利用EPS形成較穩定的立體結構直至生物膜成熟。EPS主要由胞外多糖、鼠李糖脂、胞外eDNA、蛋白質組成[8]，形成的生物膜含有微米大小的微孔水通道用于物質交換，包括空氣、水分和營養物質的傳輸，代謝廢物的排出，細菌可以利用孔道進行信息交換[9]。胞外多糖主要由藻酸鹽、psl多糖、pel多糖組成，psl和pel多糖均由相關基因編碼的酶系合成。而QS系統調控合成的藻酸鹽作為胞外多聚物的主要成分，是細菌生物膜物理結構的基礎，起到生物膜“支架”的作用[10]，同時藻酸鹽具有抗原性，能限制巨噬細胞的吞噬和炎癥因子介導，干擾宿主的免疫反應[11]。這也是黏液型PA更能抵抗藥物和宿主的攻擊，引起感染遷延不愈的原因。

2.2生物膜的耐藥機制 生物膜細菌耐藥性是多因素共同作用導致的，生物膜為細菌提供了物理屏障，抗菌藥物難以滲透，當藥物作用于細菌時，其濃度已經遠小于體外藥敏實驗所需的抑制濃度[12]。同時生物膜中的酶類可以將抗菌藥物酶解，使生物膜局部的藥物濃度降低，以達到保護細菌的目的。加之生物膜深部細菌代謝廢物的積聚，局部理化性質改變，例如pH值的下降和低氧環境，抗菌藥物的作用環境惡劣，限制了其抗菌活性[13]。此外，因為EPS組成成分使生物膜具有攜帶負電荷的屬性，當多黏菌素B和妥布霉素此類帶有正電荷的藥物與生物膜接觸時可被其阻滯在表面而降低效能[10,14]。最后，生物膜的厚度增加使得下層細菌處于缺氧、營養物質缺乏的環境，細菌可以誘導自身進入“休眠狀態”，對外界刺激的敏感性下降，耐藥性增強，這也是造成PA慢性感染和定植的重要原因[15]。上述機制說明，QS系統所表達的產物對生物膜的功能實現起到支撐作用，同時也揭示了體外藥敏試驗提示細菌敏感，但臨床抗菌治療時卻往往效果較差的真相，這與生物膜對細菌的多重保護有著密不可分的關系，需從生物膜生成的源頭解決問題。

3 QS的應對策略

3.1群體感應系統抑制劑(QSIs) QSIs是一類可以靶向作用于QS系統并抑制其功能表達的一類物質，相較于傳統的抗菌藥物，其通過阻斷細菌之間的通訊機制發揮作用而不直接殺死細菌和對其生長造成影響，因此該策略產生的選擇壓力較低并降低了治療過程中細菌耐藥性發展速度。

3.2植物提取物的QSIs活性 因為自然界植物種類的多樣性，植物中可提取出對QS系統具有抑制作用的化合物，該類物質具有安全、低毒、環保的特點。國內外研究者開始致力于尋找植物中潛在的QSIs，近年來發現生姜、大蒜、甘草、綠茶、羌活、鼠尾草、亞油酸等多種植物中的提取物具有QSIs活性，可抑制PA-QS系統毒力因子的表達和生物膜的形成[15-23]。其中研究較多的是生姜的提取物，研究發現生姜中具有姜黃素、姜油醇、姜辣素、棉子糖等多種QSIs活性物質，并進行了姜黃素與阿奇霉素聯用[15]、與金屬銅結合[24]、與納米材料結合[19]對QS系統抑制作用的研究，發現姜黃素具有良好的QSIs性能。上述天然提取物的QSIs作用機制也有所不同，其中大蒜中二烯丙基硫化物攜帶的硫醚基團可抑制3個子系統的AI受體活性[16]，亞油酸調控了細菌第二信使環二鳥苷酸的降解[18]，而姜辣素衍生物競爭性抑制了AHL和C4-HSL與受體的結合[20]，減少生物膜形成和毒力因子的產生。但除此之外的大多數研究僅停留在轉錄層面，僅對QS系統基因的表達和毒力因子的產生進行分析，而對具體作用機制的探索較少，同時僅有少數研究進行了秀麗隱桿線蟲或小鼠的體內實驗，天然QSIs的體內活性和不良反應尚未明確，這是都是今后的重點研究方向。

3.3抗菌藥物作為QSIs PA作為產生物膜的典型菌種具有多重耐藥特點，抗菌藥物的濫用更是加重了細菌的選擇壓力，所以需要更合理的抗菌藥物應用策略，而臨床常用的大環內酯類抗菌藥物如阿奇霉素、紅霉素和克拉霉素已被證明具有良好的QSIs活性。研究顯示，在亞抑菌濃度阿奇霉素的處理下，實驗組的臨床分離菌均未能產生C4-HSL分子，其鼠李糖脂、蛋白酶、生物膜的產生均大幅減少[21]，而紅霉素同樣有類似的作用，其原理是抑制了LasR、PqsA等基因的表達和細菌的群集[25]，同時阿奇霉素和克拉霉素在與慶大霉素等藥物聯用時表現出較強的協同作用[26]。而對于β內酰胺類抗菌藥物相關研究較少，有研究者將頭孢哌酮與金屬鐵、鈷結合，其衍生物表現出對QS系統的抑制作用，原理是藥物與AI受體結合使其失活[23]。還有研究發現頭孢他啶在亞抑菌濃度下可減少凝集素LecA、LecB、Pel、Psl基因的表達[27]。與之相反，國內一項研究卻發現在治療PA慢性感染時頭孢他啶使QS系統基因表達增加[24]，這或許是細菌對于不良刺激的應激反應所致，值得進一步研究。此外近年來還有少數對于氨基糖苷類和喹諾酮類藥物的研究，例如慶大霉素、左氧氟沙星在亞抑菌濃度下降低了QS系統相關毒力因子的表達[28]。在環丙沙星與阿米卡星聯用時，可以殺滅低耐藥浮游菌，但對細菌生物膜的根除效益不明顯[29]。綜上所述，各類抗菌藥物均被證實具有不同程度的QSIs活性。其中大環內酯類抑制作用顯著，并且與其他藥物聯用時起到協同作用，增強抗菌效能，故臨床對PA感染的治療過程中可考慮聯用此類抗菌藥物及延長給藥時間以達到更好的抗菌效能，而頭孢他啶因為其QSIs作用尚未明確，在治療慢性PA感染時應謹慎使用，以延緩PA耐藥性的發展。

3.4人工合成的QSIs 通過對天然QSIs分子結構的了解，讓人工合成QSIs成為可能，而廣泛存在于各類植物中的鹵代呋喃酮就是典型代表，鹵代呋喃酮的QSIs活性于1993年首次在紅藻中被發現[30]，其具有與AHL類似的結構，可競爭性結合lasR受體抑制QS系統，但天然呋喃酮對QS系統的抑制作用極為有限，因此對其進行化學修飾以提高QSIs活性成為研究的焦點，其中對于溴化呋喃酮(C-30)的研究較多，既往的研究普遍認為C-30主要通過抑制LasR受體來發揮QSIs作用，但最近研究發現，C-30可獨立于LasR抑制Rh1R并同樣具有顯著活性，同時C-30對的QS系統的抑制可能不在基因水平，而可能在轉錄后水平[31]，這超出了人們既往的認知，也說明呋喃酮衍生物的潛力還有待發掘。與此同時，受呋喃酮的啟發，有研究者通過引入硫醚基團或苯基脲基團合成了四類新型L-高絲氨酸內酯類似物，發現側鏈末端連接有苯基脲基團的11f化合物對QS系統基因的表達、毒力因子的產生和細菌群集的抑制作用均強于C-30，有著優異的QSIs活性[25]。上述研究再一次說明，QSIs的功能往往是由其特有的分子結構所實現的，通過對于AI的活性基團和靶受體功能位點的剖析，可以人為修飾甚至創造所需要的QSIs，此類物質相較于天然提取物更具有針對性和高效性，具有廣泛的前景。但另一方面，人工合成QSIs少有體內實驗的報道，其體內毒性和人體的安全性還有待論證。

3.5其他類型的QSIs 近年來隨著藥物的研發難度愈發增大，“老藥新用”成為一個新的研究策略，研究者發現了一些非抗菌藥物同樣具有QSIs活性，西格列汀作為治療2型糖尿病的一線用藥，被發現具有結合AI受體的特性，在2 mg/mL濃度下顯著抑制了PA生物膜、綠膿素、彈性蛋白酶等毒力因子的生成和QS系統相關基因的表達[32]。別嘌呤醇在200 μg/mL的濃度下也具有和西格列汀類似的作用，其機制同樣是與QS系統相關受體結合起到抑制作用[26]。而非甾體類藥物的研究則更多，其中布洛芬[33]、美洛昔康[27]、撲熱息痛[34]均被證明存在QSIs活性，布洛芬在75 μg/mL時對QS系統相關基因表達最為明顯，而如果要對綠膿素、鼠李糖脂等毒力因子的顯著抑制則需要達到100 μg/mL甚至更高，美洛昔康在15.63 μg/mL濃度下發揮QSIs作用，并表現出對于抗菌藥物的協同作用。上述藥物在亞抑菌濃度下對細菌的生長均沒有抑制作用，所以不會對細菌產生選擇壓力，具有廣泛的應用前景，通過進一步藥理研究和體內實驗，或許能給PA的臨床治療提供新的選擇，同時節省了研制新藥所需的大量時間、金錢和精力。

4 小 結

隨著近年來QS系統調控PA生物膜形成機制研究的深入，雖然種類繁多的QSIs被發現，但仍然沒有找到能有效根除體內PA生物膜的辦法，細菌耐藥性問題日益加劇，抗菌藥物的作用也在快速弱化，所以尋找新的QS抑制策略十分急迫，目前所發現的QSIs仍然存在體內毒性未知，起效濃度過高，穩定性差，易降解等諸多問題，限制了QSIs的進一步研究，但近年細菌環二鳥苷酸信使分子，sRNA調控旁路和外排泵的研究已有較大進展，同時結合計算機對接分析、分子動力學模擬，以及化學成分的吸收、分布、代謝、排泄、毒性進行分析等新興技術可對QSIs進行篩選和處理[33-34]，繼續加大對已有藥物的研究和中醫藥的發掘，相信不久的將來會有更多優異的QSIs和QS抑制策略被發現，并應用于臨床。