乳制品明膠檢測技術研究進展

宋健

(沈陽市食品藥品檢驗所理化檢驗室，沈陽 110136)

0 引言

明膠為水溶性蛋白質高分子多肽高聚物，是由不同動物中的膠原經部分水解而獲取[1]，營養價值高，廣泛用于食品、醫藥等領域。明膠作為一種親水性保護膠體，乳化作用強[2]，能夠有效抑制乳制品等高蛋白食品因胃酸而產生的凝聚反應，從而快速促進乳制品等食品的消化[3]。然而工業明膠與食品級明膠不同，其危害人體健康。工業明膠在制造過程中產生大量的六價鉻和砷等[4]，并且使用五氯苯酚作為防腐劑，因此國家禁止將工業明膠添加到食品中[5]。目前單純對于明膠的測定無法區別工業明膠和食品級明膠。針對于工業明膠的檢測研究非常少。

目前，我國的食用明膠行業發展迅速，市場應用前景廣闊，明膠在乳品中的需求將不斷增長。明膠在不斷增長的市場需求刺激下，乳制品生產商不得不在配方中使用多種成分明膠產品[6-8]，使其滿足需求。市場的迅速發展以及利益驅使下，明膠摻假現象時有發生，因此需要加強乳制品明膠檢測的監督與管理。本研究在分析明膠和乳制品特性的基礎上，研究不同明膠檢測方法的應用特性，為乳制品中明膠的檢驗提供有利依據。

1 明膠在乳制品行業的應用

明膠是一種大分子親水性蛋白質混合物，使用過程中能夠達到起泡和穩泡的效果[9]。明膠因特殊的凝膠網狀結構在乳制品生產過程中起到多種功能。明膠通過氫鍵作用[10]阻止乳清析出，避免酪蛋白的收縮反應，阻止固相從液相中產生分離；明膠可以為酪蛋白提供穩定的環境，防止酪蛋白在酸性環境下中會失去乳化能力[11]；明膠與水結合形成明膠薄層覆蓋脂肪球[12]，包裹空氣氣泡，從而保持穩定的乳化狀態。

明膠可以使低脂酸奶達到類似高奶油含量酸奶的組織狀態，在軟質干酪生產過程中通過與水結合起到穩定效果，有效阻止乳清的析出[13-15]。由于明膠融點非常接近人體溫度，使得明膠產品具有滑潤細膩的口感和風味。明膠能夠抵抗游離水受熱變化所引起的食品變質，從而減緩冰晶的成長[16]，降低溫度對冰激凌存儲時間的影響，進而減慢冰激凌的融化速度。

2 分析方法

明膠獨特的高分子結構特性賦予其多種功能，這些功能使其廣泛應用于生活各方各面。明膠的大量應用的同時，加強明膠檢測與監管成為一種必然需求[17-19]。目前，各界學者比較認可的明膠檢測方法主要包括光學與光譜法[20]、沉淀分離法、液相-色譜法、免疫吸附法。本文對上述方法的特點與局限性進行詳細分析，如表1所示。

表1 多種明膠檢測方法的比較

2.1 光學分析與光譜技術法

光學分析法是基于明膠中特定物質對光的選擇吸收而建立的分析方法，其中包括比色法、紫外分光光度法、紅外分光光度法等。

動物明膠中的膠原蛋白經過濃酸的水解作用，分離出其特有的羥脯氨酸，其經過氯胺T的氧化作用，最終轉化成含有吡咯環的氧化物[21]。用高氯酸分解過量的氯胺T后，羥脯氨酸氧化物與對二甲氨基苯甲醛相互作用生成紅色的化合物，然后利用紫外可見分光光度計測定其吸光值[22]，最后與標準系列定量比較。此方法不需要衍生，簡單有效，檢測成本低。

分光光度是一種檢測明膠中特定物質含量的傳統方式，常規的分光光度法要輔助一定的分離手段以提高檢驗準確度，操作簡便，應用較廣。原子吸收光譜法是將待測樣品氣化為基態原子，然后分析特征線譜和線譜被削弱程度的一種方法。在一定檢測范圍內，吸光度與被測元素濃度成正比。此方法是測定明膠中鉻含量的主要方法[23]，可避免分光光度法測定的缺陷。可分為火焰原子吸收法和石墨爐原子吸收法[24]。石墨爐原子吸收法通過微波消解法和超聲提取法對樣品進行前處理，采用原子吸收分光光度計石墨爐法測定總鉻和六價鉻含量[25]，有較好的檢出限，不受干擾，穩定性能滿足檢測要求，準確度好，能直接分析固體及較高的溶液試驗等優點，但其受干擾較嚴重，不適合做多元素分析。

太赫茲波譜[26]技術作為一種新型的檢測技術近年來得到越來越廣泛的應用，由于其特征光譜對很多極性大分子具有較強的吸收特性，更容易檢測和鑒別有毒的物品和復雜異物。明膠樣品在經過研磨等處理后，采用太赫茲投射式實驗后，可以看出食品級明膠和工業明膠存在明顯差異[27]，食品級明膠的吸光度隨著頻率增加而上升，工業明膠吸光度則有著明顯的上升后下降的趨勢。

2.2 沉淀分離法

沉淀法是利用沉淀反應，將被測明膠的某種特定元素轉變成為難容物質，并將其從溶液中分離為沉淀物，測定其重量以完成對被測明膠含量的檢測。根據沉淀劑的不同，可分為試劑沉淀法、鹽沉淀法以及化學沉淀法。魏戰峰、楊水云等借助硝酸汞和苦味酸的分步沉淀法[28]沉淀乳制品的乳蛋白和明膠，從而完成對原料奶中有無明膠的定性檢測。為了防止乳制品中乳蛋白沉淀不徹底而導致明膠檢測的假陽性，硝酸汞的含量必須嚴格滿足相應的檢測要求。苦味酸與明膠相互作用會形成非均相沉淀，形成絮狀漂浮物[29]。此種方法可采用試劑盒方式快速檢驗。Hidaka和Liu等利用明膠能夠有效促進烴基磷灰石形成從而強化磷酸鈣的形成的特性，從而通過明膠和磷酸鈣沉淀的相互反應測定明膠來源[30]。

分步沉淀法檢測明膠的敏感度和穩定性都較高，且能夠實現快速檢測，但由于沉淀法容易受到被測乳制品中其他食品添加劑的干擾，因此會為明膠檢測帶來一定困難，需要優化沉淀劑和試劑用量，加強檢測方法的抗干擾能力。

2.3 液相色譜-質譜法

液相色譜-質譜聯用技術以液相色譜法因對被測物結構破壞性小，分離范圍廣，可作為快速分離系統，質譜法因靈敏度高，結構分析準確度高，可作為檢測系統。純化后的樣品在液相色譜法下分離和離子化，經測量儀器得到質譜圖。液質聯用檢測技術體現了色譜和質譜優勢的互補，有效利用色譜對復雜樣品的高分離能力和質譜的高選擇性[31]，在食品檢測等領域有普遍的應用。因此色譜-質譜聯用成為分析微量有機混合物的有效方法。

明膠作為膠原蛋白的降解物主要由不同分子量的多肽[32]組成。這些多肽可被胰蛋白酶繼續降解，降解后的多肽經液相色譜-質譜分析后，比較多肽的氨基酸序列差異，分析特征肽的種類以鑒別明膠。高效液相色譜法對酶分解后的明膠多肽特征識別，根據色譜圖峰面積分析比較脯氨酸和羥脯氨酸含量高低，完成對明膠含量的檢測，檢測流程如圖1所示。劉琳等通過纖維連接蛋白（FN）能夠與明膠多肽反應結合的性質[33-34]，采用親和層析法分離出牛乳中的明膠多肽[35]，依據明膠多肽蛋白質的分布特性，利用親和介質分離法[36]，通過比較多肽質譜[37]的峰強度高低判別被測物質是否為明膠多肽。液相色譜-質譜檢測技術作為分析多肽組成、結構和功能重要方法之一，在結合蛋白質酶切技術的基礎上，能夠較為有效鑒別明膠，但檢測樣品前處理和分析手段較復雜，存在一定的改進空間。

圖1 液相色譜-質譜法明膠的檢測流程

M.T.Y.Yilmaz改進了HPLC-MS/MS法應用了超高效液相色譜串聯電噴霧電離-四極桿飛行時間質譜(nanoUPLC-ESI-q-TOF-MSE)方法通過檢測明膠中的標記肽以鑒別乳制品中的明膠來源[38]。在測試了豬明膠和牛明膠對應的獨特氨基酸序列后檢測乳制品中提取出的明膠[39-40]。此方法在識別乳制品中使用的明膠來源有著巨大潛力。

2.4 酶聯免疫吸附測定法

酶聯免疫吸附測定法（ELISA）作為一種特殊的試劑分析檢測方法，是基于免疫酶技術的一種新型免疫測定技術手段。此方法主要采用抗原與抗體的特異性反應將被測物與酶結合[41]，通過酶與底物產生特殊的顏色反應，用于定量檢測。ELISA常用檢測方法主要包括競爭法、雙抗體夾心法、抑制性測定法、間接法[42]。其中間接法是目前最常用的方法，如圖2所示，加入底物顯色，底物降解的量即為被測樣本抗體的量。

圖2 間接酶聯免疫吸附法示意圖

Venien等學者為了在低敏感性條件下獲得更多特定抗體，增加了抗體對膠原蛋白特定序列的抵抗，通過使用多克隆抗體，顯示氨基酸的序列變化[43-44]。于是他們從牛明膠鏈的末端肽序列選擇了一種作為肽1，從牛明膠鏈的中間部位選擇一種公認的物種特異性序列作為肽2。抗肽1抗體的反應活性在與抗肽2抗體相比較時表現為較低的活性狀態。經研究發現，抗肽2抗體與牛明膠的反應比豬明膠的反應更劇烈。為了進一步分析研究，當通過間接競爭法ELISA分析研究同樣的明膠混合物時，經檢測發現，鑒別豬明膠中的牛明膠獲得了高的靈敏度。而鑒別高凝凍強度豬明膠中的高凝凍強度牛明膠更為敏感[45-46]。因此，這種ELISA檢測技術可以用來區分牛和豬的明膠。盡管此種檢測方法在檢驗靈敏度等方面存在其特有的優越性，在檢測熟肉過程中存在的假陽性結限制了其在食品檢測中的應用，未來要在其抗干擾性方面加強研究。

3 討論

明膠作為一種穩定劑在乳制品制作和存儲過程中起到不可或缺的作用。食用明膠市場的缺口又造成乳制品生產過程中明膠添加的非法使用，乳制品中明膠的快速、準確檢測成為市場的必然要求。傳統的光譜技術與液相色譜技術一定程度上能夠檢測乳制品中的明膠源，在采用合理方法分離出明膠多肽后，通過檢測明膠多肽特有的羥脯氨酸實現明膠的快速檢測，這種方法具有快速準確的優點。兩步沉淀分離法能夠實現乳制品明膠的快捷檢測，選擇合適的沉淀試劑能夠保證明膠的高靈敏性檢測，但容易受到外界因素干擾。酶聯免疫吸附測定法等新型檢測方法以其高靈敏度、可靠性等特點成為明膠檢測方向，此方法利用抗原與抗體結合的特異性，可實現明膠的定性與定量檢測。未來的研究需要提高檢測的標準化，促進檢測產品的集成化，將基因檢測技術、生物技術、材料技術等相互融合，以實現明膠檢測全面化發展。同時，新工藝和新技術的迅速發展也會促進新明膠檢測技術的不斷涌現，實現檢測方式的多樣化。另外，在明膠的提取、純化以及抗外界因素干擾等方面也需要加強研究，為明膠檢測提供有利保障。