低聚半乳糖對益生性植物乳桿菌YW11冰淇淋加工特性的影響

賴田甜，鄭義，馬依淼，韓驍默，向蕙，馮文穎，劉少莉，姚夢柯，張敏，楊貞耐

（北京工商大學北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京 100048）

0 引言

低聚糖作為一種功能性糖在食品、藥品、保健品等領域已被廣泛應用。其中低聚半乳糖（galactooligosaccharide，GOS）是一種由半乳糖或葡萄糖連接1～7個半乳糖基而成的功能性低聚糖[1]。GOS在人母乳中含量較高，具有獨特的理化性質和生理功能，能夠選擇性地促進雙歧桿菌等益生菌的增殖，同時抑制有害菌的生長，且具有改善腹瀉、調節腸道菌群平衡、促進礦物質吸、提高免疫力等多種功能[2]。由于GOS水溶性好，黏度低，保濕性強，對酸和熱都很穩定，因此GOS一定程度上還可以改善食品質構，并使其具有特殊的風味[3]。

益生菌（Probiotics）是一類通過改善宿主菌群組成從而發揮有益作用的活性微生物，具有增強腸道防御功能，促進有益微生物繁殖，對人體健康具有重要作用[4]。將益生菌應用于食品工業可以提高食品的營養價值和功能性。由于益生菌必須達到一定數量才能發揮作用，因此在食品加工過程中如何保持益生菌活性尤為重要。據報道，低聚糖可增強益生菌在消化道的存活能力[5]；低聚糖在食品貯藏過程中對益生菌有保護作用[6-7]。但是，GOS作為一種新型功能性低聚糖，在益生菌冰淇淋中的應用及對產品微生物和理化指標的影響研究較少。將GOS與益生菌配伍使用，開發功能性健康食品，是當前國內食品工業發展的新增長點[8]。

本研究采用植物乳桿菌YW 11作為實驗菌株，該菌株為本課題組從西藏靈菇中分離篩選得到，具有良好的益生特性[9]；其產生的胞外多糖分子量為1.1×105u，具有良好的理化性質和生物活性[10]。本研究探討了不同添加量的GOS對植物乳桿菌YW 11增殖和抑制病原菌能力的影響，并將該菌株與GOS配伍應用于冰淇淋加工，進一步研究不同GOS添加量對冰淇淋理化性質、貯藏過程益生菌活性及菌株的模擬胃腸道耐受性的影響，為獲得高活性益生菌冰淇淋奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌YW11（NCBI檢索號：KM 265361）分離于西藏靈菇樣品，本課題組實驗室保藏；志賀氏菌（CICC 21534），大腸桿菌（CMCC 44825），沙門氏菌（CICC 22956）等菌株保藏于本實驗室；GOS（分析純），上海源葉生物科技有限公司。

高壓蒸汽滅菌器MLS-3750，日本Sanyo公司；S20型數顯p H計，上海Mettler公司；Elx800型酶標儀，美國博騰儀器有限公司；恒溫培養箱DHP-9032，上海一恒儀器科技有限公司；乳品發酵監控儀iCinac，法國AMSAlliance公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株活化

植物乳桿菌YW 11保存在含50%甘油的MRS培養基中，-80℃凍存。將凍存菌株接種于MRS液體培養基，37℃連續活化2代后用于進一步實驗。志賀氏菌（CICC 21534）、大腸桿菌（CMCC 44825）、沙門氏菌（CICC 22956）均保存在含50%甘油的LB培養基中，-80℃凍存。將凍存菌株接種于LB液體培養基，37℃連續活化2代后用于進一步實驗。

1.2.2 GOS對植物乳桿菌YW11產酸（p H）的影響

以添加1%、2%、4%、6%GOS的MRS液體培養基為實驗組，MRS液體培養基為對照組。活化兩代之后的植物乳桿菌YW 11按3%[11]的接種量分別接種到上述液體培養基中，置于37℃恒溫水浴鍋中，使用iCinac（12 VDC，96 W）乳品發酵監控儀對植物乳桿菌YW11生長過程中的p H進行連續數據采集。測量數據每3 min記錄一次，持續36 h。

1.2.3 GOS對植物乳桿菌YW11增殖的影響

以添加1%、2%、4%、6%GOS的MRS液體培養基為實驗組，MRS液體培養基為對照組。活化兩代之后的植物乳桿菌YW 11按3%的接種量分別接種到上述液體培養基中，37℃、200 r/min條件下震蕩培養。在培養0，4，8，12，16，20，24，28，32，36 h時取樣，使用酶標儀測定OD600 nm值。每個處理設3次重復，取平均值繪制生長曲線。

1.2.4 GOS對植物乳桿菌YW 11菌體蛋白含量的影響

以添加1%、2%、4%、6%GOS的MRS液體培養基為實驗組，MRS液體培養基為對照組。取進入平穩期的植物乳桿菌YW 11發酵液，使用低溫冷凍離心機（4℃）10 000 r/min離心5 min，用PBS緩沖液清洗沉淀物，重復3次，記錄終沉淀菌體的質量。同時使用BCA蛋白濃度測定試劑盒對上清液中蛋白的含量進行測定。計算植物乳桿菌YW 11菌體總蛋白含量，探究不同GOS添加量對益生菌蛋白含量的影響。

1.2.5 GOS對植物乳桿菌YW 11抑菌作用的影響

參照馬依淼等[12]方法，略作改動。以添加1%、2%、4%、6%GOS的MRS液體培養基為實驗組，MRS液體培養基為對照組。采用牛津杯法測定GOS對植物乳桿菌YW 11發酵液對3種致病菌（沙門氏菌、志賀氏菌及大腸桿菌）的抑制效果。活化2代之后的3種致病菌按3%的量分別接種到LB固體培養基中，混勻后倒入培養皿，待其冷卻凝固后，將滅過菌的牛津杯平穩地放在培養皿上，保證各牛津杯之間距離適當。在牛津杯中分別加100μL植物乳桿菌YW 11的發酵液即離心后的上清液，培養皿平放于37℃恒溫培養箱中培養8 h后觀察抑菌效果，并測量抑菌圈直徑大小。每個處理設3次重復。

1.2.6 益生菌冰淇淋的工藝流程

配料（鮮牛乳、脫脂乳粉、麥芽糖漿、雙乙酰酒石酸脂肪酸酯、海藻酸丙二醇脂肪酸酯）→分散均質（15 MPa，2 min）→巴氏殺菌→溫度降至37℃→接種發酵（添加植物乳桿菌YW11）→添加砂糖、羧甲基纖維素鈉、果膠、瓜爾豆膠→均質（20 MPa，2 min）→4℃老化→硬化→冷藏（-20℃）。

在冰淇淋制作中，以添加1%、2%、4%、6%GOS的植物乳桿菌YW 11冰淇淋為實驗組，以未添加GOS的植物乳桿菌YW 11冰淇淋為對照組。

1.2.7 冰淇淋理化指標的測定

p H和可滴定酸度：p H值采用pH計測定。滴定酸度測定參照于志會等[13]方法。

黏度：冰淇淋漿料老化后，采用Texture Analyzer質構儀進行黏度的測定。

硬度：冰淇淋樣品在-20℃冰箱貯存48 h后，采用Texture Analyzer XT2質構儀進行硬度的測定，P/5 Cylinder stainless探頭，直徑0.5 cm，測定速率1 mm/s，刺入深度0.5 cm。

膨脹率：根據稱量的同重量混合原料的體積V1與同重量冰淇淋的體積V2，按照下式計算冰淇淋的膨脹率：

式中V2為同重量下冰淇淋的容積，L；V1為同重量下混合原料的容積，L；

融化速率：稱取一定量-20℃貯存30 d冰淇淋成品，在25℃、相對濕度75%的環境下靜置，每隔一定時間稱其融化質量，抗融化性以融化率表示，融化率越低，說明抗融化性越好。按照下式計算融化率：

1.2.8 冰淇淋中植物乳桿菌YW 11模擬胃腸道耐受性實驗

取50 g儲存30 d的冰淇淋，與44 mL 0.05 g/L氯化鈉溶液混合制成待測試液。

模擬胃液實驗：參照盧旭[14]的方法，略作改動。用鹽酸調節磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，p H 7.4）p H至3.0，配制質量分數為0.5%的胃蛋白酶溶液，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后待用。以2%（v/v）的接種量將樣品溶液接種到體外模擬胃液中，混勻后置于37℃環境下培養2 h。之后進行活菌數的檢測。平板計數法測定活菌數并計算存活率。

模擬腸液實驗：參照鄒婷婷[15]的方法，略作改動。用鹽酸調節磷酸鹽緩沖液（PBS，0.1 mol/L，p H 7.4）p H至6.8，添加牛膽鹽與胰蛋白酶，使終濃度分別為6.0 mg/mL、1.0 mg/mL，充分溶解后，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌后待用。以2%（v/v）的接種量將樣品溶液接種到體外模擬腸液中，混勻后置于37℃下培養2 h。平板計數法測定活菌數并計算存活率。

1.2.9 冰淇淋中益生菌活菌數的測定

采用稀釋涂布平板計數法測定儲存期間冰淇淋的活菌數。取不同儲存時間的冰淇淋樣品用無菌生理鹽水稀釋，將稀釋后的樣品涂布于MRS固體培養基中，37℃倒置培養，記錄各組冰淇淋樣品-20℃儲存1～60 d后各組冰淇淋的活菌數。

1.2.10 數據分析

每個樣品至少測定3次，實驗數據采用SPSS 22.0軟件進行分析，P＜0.05表示差異顯著，使用origin8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 GOS對植物乳桿菌YW 11產酸的影響

圖1反映了添加不同量GOS的培養基隨植物乳桿菌YW 11發酵過程的p H值變化情況。由圖1可知，各組發酵培養基由最初的p H 6.20左右逐漸降低，各組均呈現先下降后趨于平穩的趨勢，但終止p H值不同。發酵培養前期，與對照組相比，GOS組培養基的p H下降更明顯（P＜0.05），這說明GOS組能促進前期植物乳桿菌YW 11的生長，代謝越快，酸度積累越高。GOS組組間p H變化無顯著性差異（P＞0.05）。發酵培養后期，對照組p H最先趨于穩定，穩定值為4.0左右；而GOS組培養基發酵終點為pH 3.90。這說明GOS的加入，使菌株對培養基利用效率更高，對植物乳桿菌YW11生長速率有一定促進作用。

圖1 GOS對植物乳桿菌YW11在37℃生長過程中pH變化的影響

2.2 GOS對植物乳桿菌YW 11增殖的影響

圖2反映了植物乳桿菌YW 11在添加不同量GOS的培養基中活菌數隨發酵時間變化的情況。由圖2可知，與對照組相比，GOS組植物乳桿菌YW 11在對數生長前期生長速率明顯加快，表明GOS可通過提高益生菌的生長速率促進益生菌的生長。由于培養基營養成分消耗，在發酵24 h左右進入平臺期[16]。此外，與對照組相比，GOS對植物乳桿菌YW 11的增殖具有顯著的促進作用（P＜0.5），隨著GOS濃度的增加，活菌數總體呈先增長后降低的趨勢，在GOS添加量為4%時活菌數達到峰值，這可能是因為高濃度的GOS在培養基中形成了較高的滲透壓，使益生菌菌體脫水，一定程度上抑制了其生長[17]。辛躍強等[18]研究表明GOS作為益生元能較好地促進植物乳桿菌的生長，且促進效果強于以葡萄糖為碳源的對照組。

圖2 GOS對植物乳桿菌YW11在37℃生長過程中活菌數變化的影響

2.3 GOS對植物乳桿菌YW 11菌體蛋白含量的影響

圖3反映了GOS對植物乳桿菌YW11菌體蛋白含量的影響。由圖3可知，較低濃度的GOS可顯著地提高植物乳桿菌YW 11的菌體蛋白含量，較高濃度的GOS對植物乳桿菌YW 11菌體蛋白含量增加效果不顯著。當GOS添加量為4%時，植物乳桿菌YW 11的菌體蛋白含量增加了近40%。菌體蛋白濃度高，意味著相同的菌體質量包含的功能性蛋白質的含量越多，益生菌的生命活動更旺盛，從而增強益生菌的功能特性。丁詩瑤等[19]研究了7株植物乳桿菌均具有一定的膽鹽水解酶活性及蛋白水解酶活性。益生菌相關酶活性的提高，有助于增強菌株的膽鹽耐受性，延長其在腸胃道的滯留時間，改變宿主的消化功能[20]。

圖3 GOS對植物乳桿菌YW11菌體蛋白含量的影響

2.4 GOS對植物乳桿菌YW 11抑菌作用的影響

植物乳桿菌可以分泌抗菌類物質，一定程度上幫助宿主在其腸胃道中抵御有害致病菌的侵襲[21-22]。本實驗研究了添加GOS后植物乳桿菌YW 11代謝產物對志賀氏菌（CICC 21534），大腸桿菌（CMCC 44825），沙門氏菌（CICC 22956）3種致病菌的抑菌效果，GOS對受試菌株的抑菌能力由抑菌圈直徑的大小反映。抑菌圈直徑越大，抑菌能力越強。如圖4所示，與對照組相比，GOS的添加能夠明顯（P＜0.05）提高植物乳桿菌YW 11的抑菌能力，但不同致病菌達到最佳抑菌效果時所需的GOS添加量有所差別。對于志賀氏菌與沙門氏菌抑菌效果最佳的GOS添加量為2%，最大抑菌圈直徑分別為1.43 cm和1.55 cm，對于大腸桿菌抑菌效果最佳時，GOS添加量為4%，其最大抑菌圈直徑為1.52 cm。低聚糖可有效調節微生物的生長，并刺激其細菌素的產生[23]。孫思睿等[24]研究發現在含GOS培養基中，植物乳桿菌KLDS1.0391更利于合成細菌素。

圖4 GOS作用下植物乳桿菌YW11代謝產物對病原菌的抑菌效果

2.5 GOS對植物乳桿菌YW11冰淇淋理化特性的影響

冰淇淋產品的理化檢測指標主要有酸度、黏度、硬度、膨脹率、融化率等，這些指標是影響冰淇淋品質和口感的主要因素。本實驗對上述理化指標分別進行了檢測。如表1所示，在相同的發酵時間條件下，漿料的p H和滴定酸度分別在5.69～5.89和35.34～48.76°T較小區間范圍內變化，但是與對照組相比，GOS添加組的冰淇淋漿料酸度略高，主要是因為GOS的添加促進了植物乳桿菌YW11的增殖，促進了菌體產酸[25]。提高冰淇淋漿料黏度有利于減少其中的游離水成分，改善冰淇淋口感，并能有效降低冰淇淋的融化速度[26]。由表1可知，隨著GOS添加量的增加，冰淇淋的黏度呈先上升后下降的趨勢，這可能由于植物乳桿菌YW 11生長過程中會產生胞外多糖，使產品具有更高的黏度，但當GOS濃度過高時會影響菌體的生長，使黏度略有降低[27]。

表1 不同添加量的GOS對植物乳桿菌YW11冰淇淋酸度和黏度的影響

如表2所示，隨著GOS添加量的增加，冰淇淋的硬度呈上升趨勢，可能是由于GOS具有良好的結合水分子的能力，可吸水溶脹形成凝膠，對維持物料結構的穩定性具有較大程度的貢獻[28]。膨脹率隨GOS添加量的增加呈先增加后下降的趨勢，GOS添加量為4%時，膨脹率最高，這可能是由于冰淇淋漿料黏度隨著GOS添加量的增加而提高，有利于其中氣泡的形成及穩定性，但是當體系過于黏稠時，氣泡穩定性降低，膨脹率下降[29]。此外，冰淇淋融化速率與其黏度變化趨勢一致，這可能是由于冰淇淋黏度越大，其抗融性越好[26]，并且GOS具有良好的持水性，對水分子具有一定的束縛作用，使其不能在體系中的其他分子之間自由移動[30]。

表2 不同添加量的GOS對植物乳桿菌YW11冰淇淋硬度、膨脹率和融化速率的影響

2.6 GOS對冰淇淋冷凍貯藏期間植物乳桿菌YW 11活性的影響

如何更好地保持益生菌產品在冷凍加工運輸過程及產品貨架期期間的活菌數和生物活性，提高益生菌產品的功能性是當前食品行業面臨的難題。益生菌需在食品和宿主中達到一定數量（通常認為在食品中不低于6 log CFU/g），且保持其代謝穩定才能提供健康功效[31]。本研究對冰淇淋冷凍貯藏60 d期間益生菌活菌數的變化進行了檢測。由圖5可知，各組植物乳桿菌YW 11在冰淇淋貯藏過程中活菌數均呈下降趨勢，這可能是因為冰淇淋基質的冷凍脅迫作用導致菌體出現不同程度的損傷，加速了菌體的死亡[32]。Aboulfazli等[33]研究表明凝凍過程會造成益生菌冰淇淋活菌數的顯著降低。但菌體活菌數仍保持在6 log CFU/g以上。本研究GOS的添加對冰淇淋中益生菌存活具有明顯的促進作用。冷凍貯藏60 d后，對照組冰淇淋的活菌數下降了2.3個對數級；GOS添加量為4%的植物乳桿菌YW 11冰淇淋活菌數最高，活菌數下降了1.93個對數級。因此，GOS的添加對益生菌冰淇淋產品活菌數的增加與保持都起到了重要的作用。耿鐵柱等[34]研究表明復合低聚糖的添加可以提高益生菌飲料的活菌數量，可有效抑制貯藏期間活菌數的下降。李勇超等[35]研究發現酸奶發酵過程中添加魔芋低聚糖可促進酸奶中益生菌的增殖，并使益生菌活菌數在貯存過程中保持較高的水平。RAJAM等[6]研究也表明低聚糖在貯藏過程中能很好地改善植物乳桿菌的生存能力，對益生菌有保護作用。

圖5 GOS對植物乳桿菌YW11冰淇淋貯藏期間活菌數變化的影響

2.7 冰淇淋中植物乳桿菌YW 11對模擬胃腸道的耐受性

人的腸胃道環境十分復雜，益生菌在胃腸道中存活的能力，將決定其能否在人體內正常發揮益生作用[19]。胃腸道環境對益生菌產品的功能特性具有重要影響，其主要表現在胃內過低的p H環境以及腸道內各類蛋白分解酶的作用會使益生菌產品中活菌數大大降低。對于益生菌的胃腸道耐受性，可通過體內或體外試驗，二者的實驗結果無顯著性差異[36]。表3顯示體外模擬胃腸道環境對冰淇淋中植物乳桿菌YW11活菌數及存活率的影響。

由表3可知，GOS組冰淇淋中植物乳桿菌YW 11菌株在模擬胃液環境中的存活率顯著（P＜0.5）高于對照組，GOS添加量為4%時菌株存活率相比對照組提高了12.66%，這表明GOS在強酸性條件下對植物乳桿菌YW 11具有較好的保護作用，可提高益生菌在人體中發揮的益生作用。同時，GOS組冰淇淋中植物乳桿菌YW 11在模擬腸液環境中的存活率均顯著高于對照組，較高水平的GOS添加量具有更好的耐膽汁保護效果，GOS添加量為6%時菌株存活率相對于對照組增加了10.98%，表明GOS可以有效地增強植物乳桿菌YW 11耐受腸液腐蝕的能力。Begley等[37]研究表明，膽鹽環境對菌體造成的脅迫主要是損傷益生菌細胞膜的結構和破壞細胞的穩定性。GOS的添加能很好地改善植物乳桿菌的耐酸耐膽鹽的能力，在菌體表面形成保護膜，在極端酸性或膽汁環境中對益生菌起到一定的隔離保護作用[6]。

表3 體外模擬胃腸道環境對冰淇淋中植物乳桿菌YW11活菌數的影響

3 結論

通過研究GOS對益生性植物乳桿菌YW 11冰淇淋加工特性的影響，結果表明，添加4%GOS能顯著促進植物乳桿菌YW 11的生長，使其菌體蛋白含量增加近40%；GOS能夠顯著提高植物乳桿菌YW11對志賀氏菌（CICC 21534）、大腸桿菌（CMCC 44825）、沙門氏菌（CICC 22956）的抑菌能力；將植物乳桿菌YW 11應用于冰淇淋加工，隨著GOS添加量的增加，冰淇淋漿料的酸度略有提高，硬度得到改善，黏度、膨脹率及融化率均呈現先升高后降低的趨勢；GOS能夠有效改善益生菌在冰淇淋凍藏期間的活性及對胃腸道環境的耐受性；當GOS添加量為4%時，冰淇淋的各項理化指標及其中益生菌活性整體上達到最佳，GOS對于改善益生菌冰淇淋的理化性質和功能特性具有重要作用。本研究為將GOS與植物乳桿菌YW 11的配伍使用，為功能性益生菌冰淇淋的研究開發提供了新思路。