乳雙歧桿菌BL-99以及副干酪乳酪桿菌ET-22增強小鼠免疫功能的研究

趙雯，劉偉賢，張海斌，馬國文，尹小靜，洪維鍊

(內蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司，呼和浩特 010110)

0 引言

免疫系統是機體最重要的防御系統，可特異性或非特異性排除侵入機體的異物，同時也是激活免疫應答、進行免疫反應和維持對應免疫效果的重要組成部分[1]，是一個需要免疫系統中各個組成緊密且有序的配合的復雜過程。這個過程主要包括了抗原的有序傳遞，細胞的激活，免疫分子的形成等一系列復雜的生理過程[2]。這些過程的有序發(fā)生促進了免疫反應的有效產生，從而對人體內部環(huán)境進行有序而有效的調節(jié)，并保持體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的平衡。國內有研究表明，乳酸菌能夠有效地影響并調節(jié)免疫功能的某些環(huán)節(jié)，主要體現在三個大方面體液免疫、細胞免疫和非特異性免疫。

乳酸菌是對宿主健康非常有益的微生物食品成分，研究表明乳酸菌可以通過直接與免疫細胞接觸或調節(jié)腸道菌群組成來改善宿主免疫功能[3]。作為人及動物腸道中最重要的一類微生物，乳酸菌在維持腸道微生態(tài)平衡中起著至關重要的作用。在腸道菌群調節(jié)、增強機體免疫力、緩解乳糖不耐癥和預防感染性腹瀉等方面發(fā)揮重要作用[4-7]，并且廣泛應用在食品、保健品和藥品等領域。近年來，越來越多的研究者傾向于關注其生理調節(jié)作用，如細菌素的分泌，肝功能恢復和氧化應激調節(jié)等，進而開發(fā)功能性發(fā)酵食品產品[8-9]。在這些研究中，細菌刺激對免疫促進特性的影響是一個有前景的部分[7,10]。許多食品微生物可誘發(fā)固有和/或適應性免疫反應，這種反應可能與不同細胞群的細胞因子產生有關[11]。

本文研究了兩種雙歧桿菌和兩種乳酸桿菌對小鼠免疫功能的調節(jié)作用，分別從單核-巨噬細胞活性測定實驗、NK細胞活性測定實驗、細胞及體液免疫實驗來綜合判定4株乳酸菌對小鼠的免疫功能的調節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗菌株及動物

動物桿菌(Bifidobacterium animalis,B0，商業(yè)菌)、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis，BL-99)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei,LPC0，商業(yè)菌)和副干酪乳酪桿菌(Lacticaseibacillus paracasei，ET-22)由內蒙古乳業(yè)技術研究院有限責任公司提供（副干酪乳酪桿菌為副干酪乳桿菌的新的命名，參考網址http://lactotax.embl.de/wuyts/lactotax/）；健康BABL/c雄性小鼠70只，購自北京華阜康生物科技有限責任公司，飼養(yǎng)于中國疾病預防控制中心動物房。

1.1.2 試劑與設備

環(huán)磷酰胺、乙二胺四乙酸二鉀，國藥集團化學試劑有限公司；RPMI 1640細胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、2-巰基乙醇，上海瑞番生物科技有限公司；鏈霉素，北京索萊寶有限公司；ConA液，天津市廣成化學試劑有限公司；無菌Hank’s液、Brd UP標記液、二硝基氟苯、豚鼠血清，美國Sigma公司；綿羊紅細胞(SRBC)，天津市大茂化學試劑廠；YAC-1細胞，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Tris-HCL緩沖液，天津市大茂化學試劑廠。

游標卡尺，金壇市雙捷實驗儀器廠；DHP-9272型電熱二氧化碳培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；精密電子天平（0.0001 g），瑞士梅特勒-托利多有限公司；全血細胞分析儀，帝斯曼公司；5804R型冷凍高速離心機，德國Eppendorf公司；振蕩器，美國Mettler-Toledo有限公司；HDL超凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；酶標儀，山東博科生物產業(yè)有限公司；分光光度計，日本電子株式會社；足趾容積測量儀、Q Exactive HFX型高分辨質譜、流式細胞儀、移液器，美國Thermo公司；溶血空斑自動圖像分析儀，德國維根斯公司；CX 43型顯微鏡，奧林巴斯株式會社；N 123002型-80℃冰箱，青島海爾股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的配制

根據實驗要求人體需求量及樣品規(guī)格，參考20 g小鼠與70 kg成人體表面積比例參數0.0026，以6.34 mg/kg為小鼠灌胃體積。

1.2.2 動物分組及模型的構建

健康BABL/c雄性小鼠112只(n=14只/組)，鼠齡6～8周，體重20～22 g，維持室溫(25±2℃)，相對濕度(55±2)%，12 h/12 h晝夜交替光照，自由進食和飲水。每組分兩籠飼養(yǎng)，每籠10只，普通飼料適應性喂養(yǎng)5 d。具體分組及樣品量如見表1所示。隨機分為6個大組，每個大組14只小鼠，每個大組中設立1個正常對照組，每種樣品設立1個劑量組。以灌胃方式喂養(yǎng)小鼠，灌胃體積為6.34 mg/kg的B0、BL-99、LPC0、ET-22，灌胃周期為28 d。

表1 動物模型分組

1.2.3 樣品采集與處理

每天觀察小鼠活動，耗食量，體重及大便性狀，并定期稱量小鼠的體重。在實驗結束后，結腸炎組的小鼠采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，離心分離血清。分離小鼠結腸，以PBS沖洗多次后，測量長度，剪切2/3存于離心管中，-80℃保存。1/3儲存于10%福爾馬林溶液中固定備用。剝離完整脾臟，稱重，計算脾臟指數。

1.2.4 碳廓清實驗

在一定范圍內，體內碳顆粒被清除速率與血碳濃度呈指數關系。以血碳濃度對數值為縱坐標，時間為橫坐標，兩者呈直線關系。此支線的斜率(κ)可表示吞噬速率。動物肝、脾重量影響吞噬速率，吞噬速率與免疫力相關。

動物連續(xù)灌胃干預28 d，稱體重，尾靜脈注射印度墨汁，注入墨汁后第2 min及第10 min，取血20μL，加入2 mL的0.1%碳酸鈉溶液中，600 nm處測定OD值。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。

以吞噬指數表示小鼠碳廓清的能力，按照公式進行計算。

1.2.5 臟器、體重比值測定

將小鼠初始體重和灌胃干預28 d后稱重分別作為初始體重和終體重，小鼠脫臼處死，取脾臟和胸腺，去盡筋膜，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重，計算脾臟、體重比值和胸腺、體重比值。

1.2.6 血清溶血素半數溶血值(HC50)的測定

用SRBC免疫動物后，血清中出現SRBC抗體(溶血素)，在補體參與下，與SRBC一起孵育，可發(fā)生溶血反應，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反應動物血清中溶血素的含量。

動物連續(xù)灌胃干預28 d后經腹腔對每只小鼠注射SRBC 0.2 mL進行免疫。4 d后，摘除眼球取血于1.5 mL離心管內，4℃放置約1 h，使血清充分析出，2 000 r/min離心10 min收集血清。取血清用SA緩沖液稀釋100倍。將稀釋后的血清加入96孔板，每孔100μL，再依次加入10%(v/v)SRBC 50μL，補體100μL(用SA溶液按1∶8稀釋)，置37℃恒溫水浴中保溫30 min，1 500 r/min離心10 min。然后樣品孔和空白對照孔各取上清液50μL，加入另一個96孔培養(yǎng)板內，加文奇氏試劑150μL，同時設半數溶血孔，加入12.5μL的10%(v/v)SRBC，再加文奇氏試劑至200μL，用震蕩期充分混勻，放置10 min后，在540 nm處用全自動酶標儀測定各孔光密度值。

溶血素的量以半數溶血值(HC50)表示，按以下公式計算：

1.2.7 抗體生成細胞檢測實驗

經過SRBC免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的SRBC混合，在補體參與下，使分泌抗體的脾細胞周圍的SRBC溶解，形成肉眼可見的空斑，溶血空斑數可反映抗體生成細胞數。

動物連續(xù)灌胃干預28 d后，經腹腔對每只小鼠注射0.2 mL的SRBC進行免疫反應。將SRBC免疫4 d后的小鼠處死，取脾，制成5×106個細胞/mL的細胞懸液。將瓊脂糖加熱溶解后，與等量雙倍的Hank’s液混合，分裝小試管，每管0.5 mL，再向管內加50μL的20%(v/v)，用生理鹽水配置)SRBC，取脾細胞懸液200μL，迅速混勻，傾倒至已刷瓊脂糖薄層的六孔板上，帶瓊脂凝固后，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1 h，然后加入SA緩沖液稀釋的補體(1∶10)，繼續(xù)孵育2 h，計數溶血空斑數。

1.2.8 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗

當T淋巴細胞收ConA刺激后母細胞發(fā)生增殖反應，活細胞特別是增值細胞中線粒體水解酶可將MTT分解為藍澤色結晶，其光密度值能反映細胞的增值情況。

動物連續(xù)灌胃干預28 d后，將小鼠處死，在75%酒精的燒杯中消毒后，無菌取脾，置于裝有3 cm×3 cm四層紗布(高壓滅菌)的小平皿中，加入適量無菌Hank’s液，用紗布將脾寶珠，用彎頭躡輕輕地將脾磨碎，制成單細胞懸液，用Hank’s液洗2次，每次1 000 rpm離心10 min，然后將細胞懸浮于2 mL的完全培養(yǎng)液中，計數活細胞數，調整細胞濃度為5×106個/mL。再將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)辦中，每孔1 mL，在其中一孔加入75μL的ConA液(相當于7.5μg/m L)，另一孔作為對照，37℃培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結束前4 h，每孔輕輕吸去上清液，加入0.7 mL的不含小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，同時加入MTT(5 mg/mL)50μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后，每孔加入1 mL酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝2孔作為平行樣，用酶聯免疫檢測儀，在570 nm波長測定光密度值。以加與不加ConA孔的光密度值的差值表示淋巴細胞的增值程度。

1.2.9 NK細胞活性測定

正常情況下，活細胞漿內含有的LDH不能透過細胞膜，當細胞受到NK細胞的殺傷后，LDH釋放到細胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進而使NAD還原成NADH，后者再經遞氫體還原成紫紅色甲胺類化合物，在490 nm處測定吸光值。

動物連續(xù)灌胃干預28 d，開始實驗前24 h將靶細胞YAC-1進行傳代培養(yǎng)，用前以Hank’s液洗2次，用含10%小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液調整細胞濃度為1×105個/m L(靶細胞)。小鼠頸椎脫臼猝死，無菌取脾，制成皮細胞懸液，用Hank’s液洗2次，1000 rpm離心10 min，再用2 mL含10%含小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基重懸，用臺盼藍活細胞染色計數(活細胞數應在95%以上)，調整細胞濃度為1×107個/mL(效應細胞)，使效靶比為100∶1。取靶細胞和效應細胞各100μL，加入U型96孔培養(yǎng)板中，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%的NP40各100μL，上述均設3個平行孔，培養(yǎng)4 h，將96孔培養(yǎng)板以1 500 rpm離心5 min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質液100μL，反應3 min，然后每孔加入1 mol/L的HCL溶液30μL終止反應，在酶標儀490 nm處測OD值，NK活性按下式計算：

1.2.10 遲發(fā)型變態(tài)反應

SRBC可刺激T淋巴細胞增值成致敏淋巴細胞，4 d后，當再以SRBC攻擊時，攻擊部位出現腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應程度。

動物連續(xù)灌胃干預28 d后，每鼠腹腔注射0.2 mL的2%壓積SRBC(v/v，用生理鹽水配制)，致敏4 d后，測量左后足趾部厚度，同一部位測量3次，取平均值。然后在測量部位皮下注射20μL的20%SRBC，注射后于24 h測量左后足趾部厚度，同一部位測量3次取平均值，以攻擊前后足趾厚度的差值(足趾腫脹度)來表示DTH的程度。

1.2.11 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬實驗

巨噬細胞具有活躍的吞噬功能，能清除體內抗原物質及變性的細胞，在特異性及非特異性免疫中均起重要作用。巨噬細胞受抗原刺激后活化，可使其吞噬功能明顯增強，吞噬百分率及吞噬指數可以反映機體的免疫能力。

動物連續(xù)灌胃干預28 d后，灌胃結束前4 d給每只小鼠腹腔注射0.2 mL的2%SRBC激活小鼠巨噬細胞，實驗當天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank’s液3 mL/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，吸取腹腔洗液0.5 mL混合液，加入玻片的瓊脂圈內。放置孵箱內37℃孵育15～20 min。孵育結束后迅速用生理鹽水將未貼壁細胞沖凈，于甲醇液中固定1 min，Giemsa染色15 min。用蒸餾水沖洗干凈，晾干，用40×顯微鏡計數吞噬率和吞噬指數。吞噬率為每100個吞噬細胞中，吞噬雞紅細胞的吞噬細胞所占的百分率；吞噬指數為平均每個吞噬細胞吞噬雞紅細胞的個數。

結果按下式計算：

1.2.12 實驗數據統計

所有試驗數據均使用SPSS軟件進行單因素方差分析，使用Origin軟件、Excel軟件和GraphPad Prism 8.02進行繪圖分析。試驗結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示，p＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌對小鼠的臟器/體重比值影響

飼喂乳酸菌粉期間，小鼠活動正常，生長發(fā)育良好，未觀察到異常體征或死亡。4株乳酸菌對小鼠的臟器/體重比值如圖1所示，從圖中可以看出，各組乳酸菌對小鼠脾臟/體重比值和胸腺/體重比值與對照組之間無顯著性差異(p＜0.05)，說明4種乳酸菌均未對小鼠脾臟和胸腺產生顯著影響作用。

圖1 小鼠體重及臟器體重比值

2.2 乳酸菌對小鼠體液免疫功能的影響

2.2.1 半數溶血值

與對照組相比，B0、BL-99、LPC0和ET-22組半數溶血值HC50均有極顯著性升高(p＜0.01)，并且全部呈陽性，如表1所示。

表1 半數溶血值HC50結果

2.2.2 抗體生成細胞數

抗體生成細胞數結果顯示，樣品組與對照組相比，B0、BL-99、LPC0和ET-22組極顯著高于對照組(p＜0.01)，并且全部呈陽性。4株菌的半數溶血值HC50與抗體生成細胞數結果均呈陽性，證明其具有體液免疫作用，如表2所示。

表2 抗體生成細胞數結果

2.3 乳酸菌對小鼠細胞免疫功能的影響

2.3.1 脾淋巴細胞轉化

小鼠淋巴細胞轉化實驗結果由加入ConA前后的吸光值差值(OD)表示，結果見表3，由表可以得出，與對照組相比，B0組顯著高于對照組(p＜0.05)，結果呈陽性，其他各組的OD差值與對照組相比無顯著性變化。

表3 小鼠脾淋巴細胞轉化實驗結果

2.3.2 遲發(fā)型免疫反應

從表4可以看出，SRBC攻擊前，各組小鼠的足趾厚度均處于同一水平，SRBC共計24 h后，小鼠足趾部出現腫脹，腫脹度使用攻擊前后足趾部厚度差值表示。通過統計分析發(fā)現，與對照組相比，B0、BL-99、LPC0組則極顯著高于對照組(p＜0.01)，結果呈陽性；ET-22組沒有顯著性，結果呈陰性。

表4 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應足趾腫脹結果

2.4 乳酸菌對小鼠單核-巨噬細胞功能的影響

2.4.1 碳廓清實驗

碳廓清實驗的吞噬指數結果顯示，除BL-99組低于對照組外，其他給予各種受試樣品的小鼠碳廓清實驗的吞噬指數與對照組相比均無顯著差異(p＞0.05)，BL-99組干預小鼠的吞噬指數與對照組相比具有顯著差異(p＜0.05)，如表5所示。

表5 碳廓清實驗中吞噬指數結果

2.4.2 NK細胞活性

從表6可以看出，除B0組外，與對照組相比，其他各組樣品的NK細胞活性均高于對照組，且差異具有極顯著性(p＜0.05)，檢測結果為陽性。

表6 NK細胞活性檢測結果

2.4.3 巨噬細胞吞噬熒光微球實驗

從吞噬細胞吞噬率和吞噬指數結果可以得出，B0組吞噬率和吞噬指數與對照組相比均無顯著性差異，BL-99組吞噬率和吞噬指數與對照組相比均具有顯著性差異，LPC0、ET-22組吞噬指數均極顯著高于對照組(p＜0.01)，BL-99、LPC0和ET-22結果呈陽性，證明其有免疫功能作用，如表7所示。

表7 巨噬細胞吞噬率及吞噬指數結果

3 結論

機體的免疫系統能夠識別和清除外來入侵物和抗原[12]，還可識別和清除體內發(fā)生突變的腫瘤細胞、衰老死亡的細胞或其他有害的成分，可以說是一道精密、復雜、保護機體抵御外來傷害的屏障。免疫系統包括免疫器官、免疫細胞、免疫分子3個部分，胸腺和脾臟屬于免疫器官[13]，免疫細胞中的NK細胞[14]與非特異性免疫有關，T細胞與細胞免疫有關，而B細胞與體液免疫有關[15]。本實驗用臟器/體重比來反映免疫功能，并分別從單核-巨噬細胞活性測定實驗、NK細胞活性測定實驗、細胞免疫、體液免疫來驗證4株益生菌是否可以增強小鼠免疫功能，依據判定標準，上述幾個指標檢測中任兩個結果為陽性，即可表明菌株具有增強免疫力的功能。

益生菌和益生元的功能復雜多樣，不同益生菌的免疫激活和調節(jié)機制不同[16]，而免疫器官的比重常常用來作為評價免疫能力的一個指標[14]。半數溶血值的測定可檢測小鼠體內產生的抗體溶血素在補體的參與下，與SRBC共同孵育后會發(fā)生溶血反應，釋放血紅蛋白來評價產生溶血素的能力；T細胞受ConA刺激后可使母細胞增殖，其轉化率可反映細胞免疫功能；NK細胞是一種免疫淋巴細胞，與抗腫瘤抗病毒有關，具有非特異性殺傷作用。

本研究發(fā)現，各組益生菌對小鼠臟器/體重比值與對照組之間無顯著性差異(p＜0.05)，說明4株益生菌均未對小鼠脾臟和胸腺產生顯著影響作用。體液免疫通過半數溶血值和抗體生成細胞數實驗發(fā)現，4株益生菌均能顯著影響小鼠體液免疫。細胞免疫結果表明，脾淋巴細胞轉化和遲發(fā)型免疫反應，B0均極顯著高于對照組，BL-99和LPC0，在遲發(fā)型免疫反應中顯著高于對照組。碳廓清實驗、NK細胞活性以及巨噬細胞吞噬熒光微球實驗結果表明，除B0以外，其他3株益生菌均對單核-巨噬細胞功能具有顯著性影響。實驗依據《保健食品功能評價技術規(guī)范》設計，同時，結果符合評價程序中“具有增強免疫力”的評價標準，因此可判斷，4株菌均具有增強免疫力的功能。

綜上，該試驗條件下的4株益生菌未對小鼠產生負面影響，并能夠從多方面增強小鼠的免疫機能。