天花粉中瓜氨酸含量的熒光檢測

陳匯鴻，向玲玲，梁韻詩，伍海婷，黃新安，張靜（廣州中醫藥大學青蒿研究中心，廣州 510405）

天花粉（Trichosanthis Radix）為葫蘆科植物栝樓的干燥根，是一種常用的中藥。其性味甘、微苦、微寒，具有清熱瀉火、生津止渴、消腫排膿的作用，常用于治療熱病煩渴、肺熱燥咳、瘡瘍腫毒[1-2]。現代醫學研究表明其提取物具有治療糖尿病、終止妊娠、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用[3-7]。 瓜氨酸是天花粉的主要特征氨基酸[8]，同時也是《中國藥典》規定的天花粉定性鑒別的標準。目前，天花粉中瓜氨酸的定量檢測主要有以下3種方法：

① 高效液相色譜法[9-10]：該法通常需要將無紫外吸收的氨基酸進行柱前衍生化，然后采用高效液相色譜對瓜氨酸衍生物進行分離和定量分析。最近也有報道采用蒸發光散射檢測器，可以直接測定天花粉配方顆粒中的瓜氨酸含量[11]。② 薄層色譜法[12]：該法通過硅膠薄層色譜將瓜氨酸與其他物質分離，然后采用茚三酮試液顯色，通過掃描峰面積而得到瓜氨酸含量。③ 紫外分光光度法[13-14]：該法的原理是瓜氨酸選擇性與二乙酰肟在強酸（硫酸＋磷酸）高溫下反應生成有紫外吸收的產物，然后通過測定反應混合液的吸光度而得到瓜氨酸含量。這3種方法都能準確測量天花粉中的瓜氨酸含量，可以為天花粉藥材的質量評價提供客觀依據，但是目前仍難以實現大規模和高通量的檢測。

基于熒光技術具有靈敏度高和便捷快速等優勢，我們在前期的工作中，設計合成了一類高選擇性的瓜氨酸熒光探針Napdialyne[15]。該化合物本身無熒光，但是在酸性條件下可以與瓜氨酸反應生成高熒光的加成產物。本研究擬使用該熒光探針首次探索天花粉中瓜氨酸含量的熒光測定（檢測原理見圖1），并與其他兩種測定方法（紫外分光光度法和薄層色譜法）進行對比，為天花粉中瓜氨酸含量的檢測提供新的技術手段。

圖1 瓜氨酸熒光探針Napdialyne的檢測原理Fig 1 Detection principle of citrulline fluorescent probe Napdialyne

1 材料

1.1 儀器

TU-1900紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；CAMAG TLC Scanner 4薄層色譜掃描儀（瑞士卡瑪有限公司）；Thermo Scientific Varioskan LUX酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；KQ-50B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ST60-4微孔板恒溫振蕩器（杭州米歐儀器有限公司）。

1.2 試藥

L-瓜氨酸對照品（上海畢得醫藥科技股份有限公司，純度＞98%，批號：RNV684）；無水乙醇、二甲基亞砜、二乙酰肟、濃硫酸、磷酸、異丙醇、三氯乙酸、正丁醇、茚三酮、冰醋酸均為分析純；天花粉藥材均購買自廣州市面藥店，分別是杏園春（河南產地），百姓大藥房（四川產地），松草堂旗艦店（安徽產地），經廣州中醫藥大學中藥學院藥用植物教研室杜勤教授鑒定，并研磨成細粉。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取4.6 mg的L-瓜氨酸對照品溶解在525 μL 50%乙醇中，配制成初始濃度為8.76 mg·mL－1的L-瓜氨酸溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精確稱取3 g天花粉粉末置于錐形瓶中，加入10 mL 50%乙醇，超聲30 min，過濾，用50%乙醇定容至10 mL，待用。

2.3 瓜氨酸含量測定

2.3.1 熒光法 在96孔板中依次加入100 μL純水、40 μL 100%（w/v）三氯乙酸水溶液、40 μL 50%乙醇、10 μL熒光探針Napdialyne（0.314 mg·mL－1，DMSO溶解）以及10 μL供試品溶液，將其置于50℃下震蕩孵育3 h。冷卻后，取10 μL反應液于90 μL DMSO溶液中稀釋后測量熒光，λex＝320 nm，λem＝376 nm。

2.3.2 紫外分光光度法 取1 mL供試品稀釋溶液，依次加入0.25 mL 30 g·L－1二乙酰肟水溶液、1 mL混合酸（V硫酸∶V磷酸＝3∶1），搖勻。置于100℃下，避光煮沸30 min。冷卻至室溫后，測定490 nm處的吸光度。

2.3.3 薄層色譜法 精密吸取樣品并點樣在硅膠板上，采用正丁醇-無水乙醇-冰醋酸-水＝8∶2∶5∶3展開，吹干后在硅膠板上噴灑茚三酮顯色劑，高溫下吹干顯色。置于薄層色譜儀中，500 nm下掃描，讀取數值。

采用以上3種方法，對河南產地的天花粉中瓜氨酸的含量進行了測定。結果熒光法、紫外分光光度法、薄層色譜法測得的瓜氨酸含量分別為2.083%（RSD＝1.7%）、1.849%（RSD＝2.7%）和1.697%（RSD＝1.2%）。數據吻合較好，這說明熒光法可以較準確地測定天花粉中瓜氨酸的含量。

2.4 線性關系考察

用50%乙醇逐步稀釋對照品溶液配制梯度對照品溶液，按“2.3”項下條件進行測定，以瓜氨酸的濃度為橫坐標（X），熒光強度/吸光度/吸收峰面積為縱坐標（Y），繪制線性標準曲線，結果在熒光法中，熒光強度與L-瓜氨酸對照品的濃度呈現出良好的線性關系，線性回歸方程為Y＝131.0X＋1.173，線性范圍為0.0017～0.44 mg·mL－1，線性系數（R2）為0.9962；在紫外分光光度法中，回歸方程為Y＝2.733X＋0.016 76，線性范圍為0.004～ 0.25 mg·mL－1，R2為0.9951；在薄層色譜法中，回歸方程為Y＝1.818×104X－59.22，線性范圍為0.024～0.30 mg·mL－1，R2為0.9953。同時，以3倍空白標準偏差除以標準曲線的斜率，估算熒光法的檢測限（LOD）為0.39 μg·mL－1。

2.5 精密度考察

精密吸取供試品溶液，按“2.3.1”項下反應條件，連續檢測6次，計算得到熒光強度的RSD為0.66%，說明儀器的精密度良好。

2.6 重復性考察

精密稱取天花粉粉末適量，按“2.2”項下方法制備6份供試品溶液。按“2.3.1”項下條件進行測定，記錄熒光值，計算得到瓜氨酸含量的RSD值為1.7%，說明該方法重復性良好。

2.7 加樣回收率考察

精密稱取供試品溶液5份，分別測定瓜氨酸含量。然后按大約1∶1的比例加入瓜氨酸對照品，按“2.3.1”項下方法進行測定，計算平均加樣回收率。結果熒光法的加樣回收率在97.09%～ 106.84%，RSD值在1.6%～2.7%，說明該方法的準確度較高。

2.8 不同產地天花粉中瓜氨酸的含量測定

為考察熒光法測定天花粉中瓜氨酸含量的適用范圍，分別收集了市面藥店所售的河南、四川、安徽3個產地的天花粉，測定其瓜氨酸的平均含量分別為2.083%、1.423%、1.835%（見表1）。其結果存在一定差異，表明本方法可以用于不同產地天花粉中的瓜氨酸的定量檢測。

表1 不同產地天花粉的瓜氨酸含量測定 Tab 1 Citrulline content in Trichosanthis Radix from different producing areas

3 討論

近年來，熒光檢測技術由于快速、靈敏、便捷等優點，被廣泛應用于各種生物檢測中，但是其在中藥材鑒定和質量控制方面的研究仍較少。本研究采用課題組前期構建的高選擇性瓜氨酸熒光探針Napdialyne，首次系統地建立了一套天花粉中瓜氨酸含量的熒光測定方法。通過與其他兩種常見的瓜氨酸測定方法（紫外分光光度法和薄層色譜法）對比，筆者發現3種方法結果較為接近，測得的瓜氨酸含量分別為2.083%、1.849%、1.697%。

雖然目前已有3種方法可以用于檢測瓜氨酸含量，但在檢測的便利性上三者均存在一定的局限。高效液相色譜法對設備的要求較高，且耗時較長；紫外分光光度法需要高溫強酸的反應條件，筆者在前期的條件優化過程中也發現該法需要嚴格避光和控制時間，否則會出現較大的誤差；薄層色譜法則需要先通過硅膠薄層色譜對瓜氨酸進行分離，然后茚三酮高溫顯色，存在手工操作的差異。此外，受限于苛刻的反應條件或色譜分離步驟，這3種方法均不能用于高通量檢測。相比之下，熒光法通常在96孔板中進行，具有簡便、可靠、檢測通量高、線性范圍廣等優點，可以為天花粉的質量控制提供新的快速檢測手段。

致謝：感謝廣州中醫藥大學中藥學院張蕾教授在薄層色譜掃描儀使用上的協助。