藏橐吾藥材質量標準研究

萬玉瑩，周燕，達娃卓瑪，3*（.西藏大學，拉薩 8500；.中國科學院成都生物研究所，成都 6004；3.中藥藏藥質量控制重點實驗室 西藏自治區食品藥品檢驗研究院，拉薩 850005）

藏醫藥學是我國民族醫藥學的瑰寶，藏藥質量標準問題一直是制約藏藥發展的核心問題，其中藏藥材的標準化更是藏藥現代化的前提和基礎[1-2]。藏橐吾[Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu]是菊科（Compositae）橐吾屬（Ligularia）多年生草本，主要分布在我國的西藏東部及尼泊爾海拔3700～4500 m的灌叢、山坡等地方[3]，全草入藥[4]，是藏藥體系的常用藥材，資源豐富[5-6]。西藏珞巴族將其作為消炎藥治療咽喉疼痛[7]，但目前對其報道相對較少。藏橐吾性溫，味苦，入肺經，常與其他藏族當地的橐吾屬植物一起被稱作“日肖”，用于清熱解毒、緩解燒傷及風濕等癥狀[4]，其藥用價值在《中國中藥資源志要》中也有所記載，溫肺止咳，潤肺降氣，還有散寒、化痰以及止痰的功效[5]。

歷版《中國藥典》、各地方藥典、《衛生部藥品標準·藏藥·第一冊》正文中均未收載藏橐吾相關質量標準。本研究根據《中國藥典》2020年版第四部通則相關規定[8]，首次對藏橐吾藥材根、莖、葉及粉末的顯微特征和薄層色譜進行鑒別，并對藥典規定的常規項目進行檢查，確定使用藏橐吾藥材中大量且具有生物活性的倍半萜成分——蜂斗菜素為薄層鑒別及含量測定指標[9]，為地方藥材質量標準的制訂提供參考，為國家藥材質量標準進一步完善奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC H-CLASS液相色譜儀（四元泵，PDA檢測，柱溫箱，自動進樣器，Empower 色譜數據工作站）；色譜柱為Welch Ultimate XBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Sartorius BT 25 S（十萬分之一）、BSA124S-CW（萬分之一）電子天平（德國賽多利斯公司）；蜂斗菜素對照品（實驗室自制，純度＞99.0%）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（中國MORELLK公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

1.2 藥材

藏橐吾藥材8批次，均采自西藏自治區境內各不同地區，經西藏自治區藏醫院格桑巴珠副主任藥師鑒定為菊科橐吾屬植物藏橐吾[Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu]，藥材全草曬干，粉碎后過2號篩，混合均勻，備用。樣品信息見表1。

表1 藏橐吾藥材采集信息 Tab 1 Sample collection information of Ligularia rumicifolia (Drumm.) S.W.Liu

2 方法與結果

2.1 藥材性狀特征

藥材干燥根部呈不規則塊狀，大小不一，根肉質，多數，根簇生多數細根，長3～15 cm，直徑0.1～0.3 cm，表面灰褐色，有縱皺紋，質較柔韌，不易折斷。葉片橢圓形或卵形，長15～20 cm，寬5～7 cm，葉基呈心形，邊緣具規則的三角形齒；莖生葉無柄，基部抱莖，表面棕褐色，近圓柱形，質地較硬，易折斷，內部淡黃色，中空結構。氣微香，味苦。藏橐吾原植物及干燥藥材見圖1。

圖1 藏橐吾原植物（A）及干燥藥材（B）Fig 1 Original plant（A）and dry medicinal material（B）of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.2 顯微特征

2.2.1 根橫切面 呈類圓形，表皮細胞1～2列，直徑約24 μm；外周孔隙較大，直徑為0.05～0.1 mm，環繞一周有5～7個；皮層多為薄壁細胞，直徑約48 μm，15～17層疏松排列；內周孔隙呈類圓形，周狀排列一周5～7個，直徑0.05～0.1 mm；中間有中心維管束，直徑約為橫切面直徑的1/6。韌皮部呈圓環形排列在木質部周圍，5～7列；木質部呈緊密排列圓形，約占橫切面半徑的1/16（見圖2）。

圖2 藏橐吾根橫切面Fig 2 Cross section of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu root

2.2.2 莖橫切面 類圓形，表皮細胞1列，皮層較厚，4～5列排列成環；雙韌性維管束周狀排列，一周環繞15～20個，2個旁支上各有3～4個雙韌性維管束；髓部由數十列細胞組成的環髓帶包圍。中心類圓形導管，半徑約為橫切面半徑的1/10（見圖3）。

圖3 藏橐吾莖橫切面Fig 3 Cross section of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu stem

2.2.3 主葉脈橫切面 上、下表皮細胞各1列，橢圓形或類圓形；海綿組織細胞3～5列，不規則疏松排列；柵欄組織緊密排列2～3列；中間有中心維管束，橢圓形，木質部呈疏松排列半圓形，直徑約0.2 mm，細胞大小不一；韌皮部在木質部下方，韌皮部細胞緊密排4～5列，細胞較木質部細胞較小，直徑約為木質部細胞1/2（見圖4）。

圖4 藏橐吾主葉脈橫切面Fig 4 Main vein cross section of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.2.4 生藥粉末 本品粉末灰褐色或灰綠色，葉表皮細胞分兩種，一種是上表皮，細胞呈方形或多角形，另一種是下表皮，細胞呈波浪形，氣孔不定式，副衛細胞4～5個，大小30.0～61.6 μm。纖維單個或成束存在，木纖維具紋孔。薄壁細胞類圓形，大小不等。木栓細胞類圓形，壁增厚。非腺毛較多，表面光滑。螺紋導管為主，也存在網紋及具緣紋孔導管，直徑29.8～42.9 μm。木栓石細胞多見，表面觀呈類長方形、長條形或多邊形，垂周壁連珠狀增厚，長110.1～143.5 μm，寬15.4～33.9 μm，可見細密的裂紋及紋孔。散在草酸鈣方晶，直徑35.3～55.4 μm。棕色塊不規則狀，大小不等，散在（見圖5）。

圖5 藏橐吾生藥粉末Fig 5 Crude drug powder of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.3 薄層鑒別

稱取藏橐吾藥材粉末1.0 g，加入25 mL 甲醇，常溫超聲45 min，放置室溫，過濾，取續濾液作為供試品溶液。另稱取蜂斗菜素適量，加甲醇溶解制成質量濃度為0.68 mg·mL－1的對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502），吸取上述溶液各 1 μL，點于同一硅膠 G 薄層板，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴25%磷鉬酸溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。可在樣品、對照藥材及對照品相應位置上，觀察到相同深藍色斑點（見圖6）。

圖6 藏橐吾TLC圖Fig 6 TLC of Ligularia rumicifolia（Drumm.）S.W.Liu

2.4 水分測定

不同產地的藏橐吾藥材水分含量8.58%～ 10.12%，平均值含量為9.4%。以平均值上浮20%為上限，暫定本品水分不得過 11.0%。8批樣品水分含量均在規定范圍內，藥材水分合格率為100%（通則0832 第二法）。結果見表2。

表2 水分、總灰分、酸不溶性灰分的測定結果(n＝2) Tab 2 Determination of water，total ash and acid insoluble ash (n＝2)

2.5 灰分、酸不溶性灰分測定

不同產地的藏橐吾藥材總灰分含量為5.95%～10.53%，平均值為7.8%，酸不溶性灰分含量為1.23%～4.77%，平均值為2.40%。以平均值上浮20%為上限，暫定本品總灰分含量不得過 9.5%，酸不溶性灰分含量不得過3.0%。其中在8批藏橐吾藥材中，藥材批號為Z2020-08總灰分不合格，藥材批號為Z2020-08、Z2020-07酸不溶性灰分不合格。藥材總灰分合格率為87.5%；酸不溶性灰分合格率為75%（通則2302），結果見表2。

2.6 浸出物測定

隨機選取一批藥材為代表（批號：Z2020-03），對浸出物提取方法進行考察。結果表明，以浸膏計，熱浸法以純水作為溶劑時得到浸出物含量最高。采用此方法測得8批不同產地藏橐吾藥材水溶性浸出物含量為 44.30%～50.96%，平均值為45.3%，以本品干燥品平均值的80%為下限，暫定本品水溶性浸出物不得少于32.3%。8批不同產地的藏橐吾藥材均符合要求（通則2201）。藥材浸出物合格率為100%，結果見表3～4。

表3 浸出物提取方法的考察(n＝2) Tab 3 Extraction method (n＝2)

表4 水溶性浸出物含量測定結果(n＝2) Tab 4 Determination of water-soluble extract content (n＝2)

2.7 蜂斗菜素含量測定

2.7.1 色譜條件 流動相：甲醇-乙腈-0.1%甲酸 水＝38∶43∶19（V/V/V）；色 譜 柱：Welch Ultimate?XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：232 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2.7.2 對照品溶液的制備 精密稱取蜂斗菜素對照品適量，用甲醇稀釋得到質量濃度為815.6 μg·mL－1的對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液1 mL用甲醇定容到25 mL量瓶中，得到質量濃度為32.62 μg·mL－1的對照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 精密稱取藏橐吾藥材粉末（過2號篩）0.5 g，精密加入甲醇25 mL，稱量。常溫超聲45 min，放置室溫，稱量，用甲醇補足重量；過濾，續濾液用0.22 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.7.4 系統適用性試驗 精密吸取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液（甲醇）進樣測定。結果顯示，蜂斗菜素與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5，與其他組分可以達到完全分離，對稱因子在0.95～1.05，峰形對稱，理論塔板數≥10 000。結果見圖7。

圖7 蜂斗菜素HPLC色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram of petasin

2.7.5 線性關系考察 精密量取對照品儲備液，制成7個蜂斗菜素對照品系列溶液，以對照品質量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程為Y＝7.853×104X＋8.241×104（r＝0.9996），結果表明，蜂斗菜素在9.79～45.67 μg·mL－1內與峰面積線性關系良好。

2.7.6 精密度考察 取對照品溶液連續進樣6次，記錄峰面積。結果蜂斗菜素峰面積的RSD為0.60%，表明該儀器精密度良好。

2.7.7 重復性考察 選擇同一批次藥材（批號：Z2020-06），按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液平行試驗6次，結果顯示蜂斗菜素含量的RSD為0.63%，表明該方法重復性良好。

2.7.8 穩定性考察 取“2.7.7”項下供試品溶液于0、2、6、8、10、12 h 進樣，記錄峰面積。結果蜂斗菜素的峰面積RSD為0.47%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.7.9 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的藏橐吾（批號：Z2020-06）樣品9份，每份約 0.25 g，按供試品中待測成分含量的80%、100%、120%精密加入蜂斗菜素對照品，進樣測定，結果蜂斗菜素加樣回收率分別為96.41%、96.26%、95.47%，RSD分別為1.5%、1.5%、1.8%，表明方法準確度良好。

2.7.10 樣品測定 分別取西藏不同產地的藏橐吾藥材，按“2.7.3” 項下方法制備供試品溶液，進樣測定，外標法計算藏橐吾藥材中蜂斗菜素的含量。結果8批藥材中蜂斗菜素含量范圍 0.116%～0.168%，平均含量為0.141%。以平均含量的80%為限（按干燥品計算），暫定藏橐吾樣品中蜂斗菜素含量不得少于0.1%。8批不同產地的藏橐吾藥材均符合要求，結果見表5。

表5 蜂斗菜素含量測定結果(n＝3) Tab 5 Content determination of petasin (n＝3)

3 討論

3.1 對照品的選擇

據文獻報道，藏橐吾主要化學成分有黃酮類[10]、單萜[10]、生物堿類[11]、倍半萜類[9，12-15]等，且認為從橐吾屬植物中分離出的倍半萜類物質是抗菌的主要活性成分[13]。

Ye等[9]從藏橐吾藥材中分離出45個倍半萜類成分，艾里莫酚烷型的倍半萜蜂斗菜素作為其中一個大量且特征性成分，具有抑菌、抗炎[16]、舒張血管[17]、抗腫瘤[18-21]、解痙、抗白三烯、抗組胺[22]等多種藥理活性。因此，考慮臨床功效、含量、特征性和分離難度等因素，本課題組將蜂斗菜素作為指標成分，進行藏橐吾藥材質量標準研究。

3.2 薄層色譜鑒別

3.2.1 展開劑、薄層板類型的考察 考察了5種不同類型展開劑系統：石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）、石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶1）、石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（2∶0.5∶0.5）、二氯甲烷-乙酸乙酯（4∶1）、二氯甲烷-甲醇（10∶1），結果在石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（3∶1）和石油醚（60～90℃）-丙酮（5∶1）展開劑體系下，分離效果較好，且Rf值適中，相比之下，前者分離效果和對照物質成點性更好，Rf值0.65左右，展開后斑點清晰明顯，無拖尾，符合藥典相關規定。

3.2.2 顯色劑的考察 考察4種顯色劑顯色效果（25%磷鉬酸溶液、5%硫酸-乙醇溶液、2% FeCl3-乙醇溶液、1%香蘭素-硫酸溶液）。結果25%磷鉬酸溶液作顯色劑展開后斑點清晰，背景無干擾。

3.3 含量測定

3.3.1 供試品溶液制備方法的考察 采用不同濃度的甲醇、乙醇溶液（50%、70%、100%）作為提取溶劑，當提取溶液是100%甲醇時，得到蜂斗菜素含量最高。在此基礎上，考察冷浸、超聲、回流三種提取方式在不同提取時間下對蜂斗菜素提取含量的影響，結果表明超聲45 min時，提取效率最高。

3.3.2 流動相的考察 考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水（0.1%、0.2%）、乙腈-水、乙腈-甲酸水（0.1%、0.2%）等二元流動相體系，發現很難將目標峰與周圍峰很好分離，在此基礎上考察三元流動相體系甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-甲酸水（0.1%、0.2%），結果綜合考慮壓力、峰形以及樣品分離效果等因素，最終確定流動相為甲醇-乙腈-0.1%甲酸水＝38∶43∶19。

3.4 小結

本研究通過對多產地藏橐吾藥材性狀描述、顯微鑒別及初次建立薄層鑒別方法，可知該植物鑒別特征明顯，可作為藏橐吾藥材的鑒別依據；通過對藏橐吾藥材各檢查項及浸出物測定，初步確定各常規試驗項限量；通過首次建立蜂斗菜素對照品的含量測定方法，初步確定藏橐吾藥材質控指標性化學成分及限量，為其品種鑒別、地方藥材質量標準的制訂及進一步開發利用提供依據。