消糖靈片的超高效液相色譜指紋圖譜建立、含量測定 及化學模式識別

王素娟，賀凡珍，王乾蕾，李哲，許潤娟（中山市食品藥品檢驗所，廣東 中山 528437）

消糖靈片是臨床常用的降糖類藥物，由11味中藥（知母、天花粉、黃連、白芍、黃芪、人參、枸杞子、丹參、五味子、杜仲及沙苑子）與西藥格列本脲組成，具有益氣養陰、清熱瀉火、益腎縮尿之功效，臨床上用于治療陰虛燥熱、氣陰兩虛所致的消渴病，癥見口渴喜飲、體倦乏力、多食、多尿、消瘦；2型糖尿病見上述癥候者[1]。消糖靈片質量標準收載于國家食品藥品監督管理局新藥轉正標準第七十六冊（標準號為YBZ03442004-2008Z），原質量標準對黃芪甲苷、人參皂苷Re和人參皂苷Rg1、黃連藥材進行了薄層鑒別，并對芍藥苷與格列本脲進行了含量測定。但僅對部分藥味進行薄層色譜鑒別和含量測定，無法全面反映產品的質量。目前尚未見有消糖靈片化學成分與指紋圖譜的相關研究報道[2-3]。 中藥復方制劑由多味中藥材共同配伍而成，通過不同活性成分共同作用達到治療疾病的目的，因此對中藥復方制劑質量控制的方法應能夠更加客觀、全面地反映其所含的化學成分。中藥指紋圖譜能標示中藥的化學成分特征，通過對其潛藏的大量數據和變量進行挖掘和評價，能夠有效反映出中藥內在的化學成分信息[4-5]，實現鑒別產品真實性、評價質量一致性和產品穩定性的可靠手段[4-5]。因此，本試驗旨在建立消糖靈片的UPLC指紋圖譜，并進行多組分含量測定，結合化學模式識別方法對所得數據進行綜合分析，為消糖靈片的質量評價和控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY UPLC H-CLASS 超高液相色譜儀，PDA檢測器（美國沃特世公司）；Millipore Integral-5超純水機（德國默克公司）；METTLER XS 205電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多）；超聲波清洗機（天津瑞普）。

1.2 試藥

15批消糖靈片樣品（7批由廣東先通藥業有限公司提供，8批購自市場），具體信息見表1。對照品綠原酸（批號：110753-201817，含量：96.8%）、芒果苷（批號：111607-201704，含量：98.1%）、芍藥苷（批號：110736-201943，含量95.1%）、鹽酸黃連堿（批號：112026-201802，含量：94.0%）、鹽酸巴馬汀（批號：110732-201913，含量：85.7%）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201814，含量：86.7%）、五味子醇甲（批號：110857-201815，含量：99.7%）、格列本脲（批號：100135-201806，含量：99.5%，HPLC）（中國食品藥品檢定研究院）；對照品毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：PF190926-15，含量：98.87%）、沙苑子苷（批號：PF190618-05，含量：98.56%）、丹酚酸B（批號：PF191019-03，含量：98.66%）（Stanford Chemicals公司）；對照品芍藥內酯苷（批號：O0970010，含量：99.4%，上海安譜實驗科技股份有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純（MERCK公司），超純水由Millipore超純水機制備。

表1 消糖靈片樣品信息 Tab 1 Samples of Xiaotangling tablet

2 方法與結果

2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（2.1 mm× 100 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%磷酸水（加1 mL三乙胺調pH至2.6）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，98%～84%A；10～14 min，84%～77%A；14～22.5 min，77%～70%A；22.5～33 min，70%～30%A；33～36 min，70%A）；體積流量0.2 mL·min－1；柱溫30℃；進樣量2 μL，檢測波長230 nm。

2.2 消糖靈片UPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 指紋圖譜對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品（綠原酸、芒果苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、沙苑子苷、鹽酸黃連堿、丹酚酸B、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、五味子醇甲、格列本脲）各約5 mg，加甲醇溶解定容于10 mL量瓶中，配制成質量濃度約為0.5 mg·mL－1的對照品儲備液；分別精密量取2 mL，置同一50 mL量瓶中，用50%甲醇水溶液稀釋定容至刻度，制成質量濃度約0.02 mg·mL－1的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取消糖靈片10片，除去薄膜衣，研細，混勻，精密稱取0.4 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇水溶液25 mL，密塞，超聲處理（40 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇水溶液補足減失的重量，搖勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 精密度試驗 精密吸取樣品 S6 供試品溶液6份，進樣測定，測得各共有色譜峰相對保留時間RSD小于1.0%，相對峰面積RSD值在0.20%～2.9%。表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復性試驗 精密稱取樣品 S6共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，測得各共有峰相對保留時間RSD小于1.0%，相對峰面積RSD值在0.52%～2.9%，表明該方法重復性良好。

2.2.5 穩定性試驗 在“2.1”項條件下，分別于0、2、4、6、12、24 h精密吸取樣品 S6 供試品溶液進樣，測得各共有色譜峰相對保留時間RSD小于1.0%，相對峰面積RSD值在0.38%～2.4%。表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.6 指紋圖譜建立及相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012.1版本）對所得的不同批次消糖靈片的指紋圖譜數據進行分析，以S6為參照色譜圖，采用多點校正法建立指紋圖譜[6]，得到15批消糖靈片指紋圖譜見圖1，相似度計算數據顯示，15批消糖靈片樣品的指紋圖譜相對于對照指紋圖譜（R）的相似度均大于0.996，結果見圖2。

圖1 15批樣品UPLC指紋圖譜Fig 1 UPLC fingerprints of 15 batches of samples

圖2 15批樣品相似度計算結果Fig 2 Similarities of 15 batches of samples

2.2.7 色譜峰指認 在消糖靈片UPLC指紋圖譜中共標定25個共有峰，通過與混合對照品溶液圖譜的峰保留時間及光譜圖對照，分別指認了12個色譜峰。其中4號峰為綠原酸，5號峰為芒果苷，8號峰為芍藥內酯苷，10號峰為芍藥苷，11號峰為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，14號峰為沙苑子苷，17號峰為鹽酸黃連堿，18號峰為丹酚酸B，19號峰為鹽酸巴馬汀，20號峰為鹽酸小檗堿，23號峰為五味子醇甲，25號峰為格列本脲，結果見圖3。

圖3 混合對照品溶液的UPLC色譜圖Fig 3 UPLC chromatography of mixed reference substances

2.3 7種組分的含量測定

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品（鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲）各適量，分別置于20 mL量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成各對照品儲備液；分別精密取各對照品儲備液適量，加50%甲醇水溶液制成鹽酸小檗堿質量濃度分別為11.319、22.639、45.279、90.558、181.116 μg·mL－1，鹽酸黃連堿質量濃度分別為8.800、17.601、35.203、70.406、140.812 μg·mL－1，芒果苷質量濃度分別為0.8497、1.699、3.399、6.798、13.596 μg·mL－1，芍藥苷分別為4.454、8.909、17.82、35.64、71.28 μg·mL－1，毛蕊異黃酮葡萄糖苷分別為2.236、4.472、8.944、17.89、35.78 μg·mL－1，五味子醇甲分別為0.7415、1.483、2.966、5.932、11.86 μg·mL－1， 格列本脲分別為3.783、7.567、15.13、30.15、60.54 μg·mL－1的混合系列對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 同“2.2.2”項下操作。

2.3.3 系統適用性試驗 取混合對照品溶液、供試品溶液（編號S6）和空白溶液（50%甲醇水溶液）適量，進樣測定，記錄色譜圖。結果各待測成分的色譜峰分離度均大于1.5，理論板數均大于80 000，拖尾因子為0.9～1.4，空白溶液對7種成分的測定無干擾，見圖4。

圖4 供試品（A）、混合對照品（B）和空白溶液（C）色譜圖Fig 4 UPLC chromatogram of Xiaotangling tablets（A），mixed reference（B）and blank solution（C）

2.3.4 線性關系考察 精密吸取“2.3.1”項下各混合系列對照品溶液，進樣測定，記錄色譜圖。以各待測成分質量濃度（X，μg·mL－1）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，結果見表2。

表2 7種組分的回歸方程與線性范圍 Tab 2 Regression equation and linearity of 7 components

2.3.5 精密度試驗 取“2.3.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲峰面積的RSD分別為0.060%、0.10%、0.35%、0.20%、0.26%、2.0%、0.21%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 取消糖靈片樣品（編號S6）0.4 g，共6份，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果7種成分峰面積的RSD在0.52%～2.3%，表明方法重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗 取“2.3.2”項下供試品溶液（編號S6）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h，進樣測定，記錄峰面積。結果7種成分峰面積的RSD在0.38%～2.3%。

2.3.8 加樣回收試驗 取已知含量的消糖靈片樣品（編號S6）約0.2 g，共9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入7種對照品儲備液（各3份），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲的平均加樣回收率分別在96.11%～101.06（RSD在0.27%～1.1%）、94.96%～96.46%（RSD在0.32%～0.82%）、98.60%～103.74%（RSD在1.1%～1.4%）、94.53%～99.10%%（RSD在0.23%～0.58%）、98.45%～99.97%（RSD在0.63%～2.1%）、95.17%～97.27%（RSD在1.1%～1.9%）、98.81%～100.9%（RSD在0.41%～1.3%）。

2.3.9 樣品含量測定 取消糖靈片15批，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。測得樣品中鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲的含量分別在3.951～4.356、1.325～1.665、0.205～0.331、2.444～3.119、0.184～0.296、0.264～0.380、1.598～1.786 mg·g－1，結果見表3。

表3 15批消糖靈片中7個成分含量的測定結果(n＝3，mg·g－1) Tab 3 Content of 7 components in 15 batches of Xiaotangling tablets (n＝3，mg·g－1)

2.4 化學模式識別方法

2.4.1 聚類分析（CA） 應用SPSS 20.0軟件，以共有峰的相對峰面積為變量，對消糖靈片樣品的數據進行聚類分析，采用組間平均連接法，以歐氏距離為度量標準[7]，結果見圖5。當距離刻度為25時，15批樣品主要分為2大類，S2、S3、S5、S6、S7、S8、S9、S11、S13、S14、S15為第1類，S1、S4、S10、S12為第2類。

圖5 15 批樣品聚類樹狀圖Fig 5 Dendrogram of cluster analysis of 15 batches of samples

2.4.2 主成分分析（PCA） 以各批次消糖靈片的指紋圖譜所得共有峰的峰面積為變量，構建15×25的原始數據矩陣，通過變量統計分析軟件（SIMCA 14.1）對15批消糖靈片樣品進行PCA，繪制出主成分分析圖，結果見圖6，表明15批消糖靈片樣品呈現的分類與聚類分析結果基本吻合。PCA載荷圖中的每一個點表示為一個色譜峰，其與原點（0，0）的距離越遠，代表該色譜峰對樣品整體分布貢獻的程度越大[8]。3、4、5、6、10、11、12、13、14、16、17、19、20、22和25號色譜峰在坐標系中距離原點較遠，表明其對消糖靈片的質量有重要影響，見圖7。

圖6 15 批樣品PCA圖Fig 6 PCA plot for 15 batches of samples

圖7 15 批樣品PCA載荷圖Fig 7 Load scatter diagram of 15 batches of samples

2.4.3 OPLS-DA 本研究采用OPLS-DA模型對樣品的數據進一步分析，得到各批次樣品間的差異性成分，見圖8。

圖8 15批樣品OPLS-DA分析散點圖Fig 8 Scatter diagram of OPLS-DA of 15 batches of samples

為篩選出對上述樣品分類貢獻較大的成分，以變量投影重要度（variable importance for the projection，VIP）＞1.0 為篩選標準[9]，對數據進行處理分析。共得到10個有意義變量，按照變量投影重要度值大小依次為13號峰＞17號峰（鹽酸黃連堿）＞20號峰（鹽酸小檗堿）＞16號峰＞2號峰＞18號峰（丹酚酸B）＞25號峰（格列本脲）＞5號峰（芒果苷）＞10號峰（芍藥苷）＞11號峰（毛蕊異黃酮葡萄糖苷），結果見圖9。這些成分是導致15批樣品之間差異的主要原因，有一定的標志作用，該結果與PCA中載荷圖的分析結果基本一致。在以后對消糖靈片的研究中可以重點關注上述成分的質量變化，以便更加系統、高效地評價藥物質量。

圖9 15批樣品各成分VIP圖Fig 9 VIP diagram of various constituents from 15 batches of samples

3 討論

3.1 提取條件的優化

本研究在制備消糖靈片UPLC供試品溶液時，結合處方工藝和各組分化學性質[10-15]，曾分別采用超聲（15、30、60 min）、加熱回流（60、80、100℃）的方式進行提取，并進行了提取溶劑的篩選（不同比例的甲醇水溶液、乙醇水溶液等）。結果顯示，加熱回流提取耗時長，并且溫度高于80℃時提取60 min，格列本脲有降解。50%甲醇水溶液超聲提取所得色譜峰信息最多，更能兼顧各藥材所含化學成分，最終選擇50%甲醇超聲30 min進行提取。

3.2 色譜條件的優化

分別對流動相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-酸水、乙腈-酸水）、色譜柱[ Waters CORTECS UPLC C18（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）、Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Agilent SB C18（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）]、體積流量（0.15、0.20、0.25、0.3 mL·min－1）、柱 溫（25、30、35℃）、檢測波長（210、230、254、280、320 nm）進行考察，綜合峰響應強度和數量、基線平穩性、分離度效果，最終確定Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，乙腈-0.1%磷酸水（加1 mL三乙胺調pH至2.6）梯度洗脫，體積流量0.2 mL·min－1，檢測波長230 nm，柱溫30℃為色譜分析條件。

3.3 相似度分析與含量測定分析

本研究建立的消糖靈片UPLC指紋圖譜，可以反映消糖靈片處方中各味藥材所含化學組分的信息。相似度評價結果表明，各批次的消糖靈片指紋圖譜具有高度的相似性，即各批樣品的化學成分一致性較好。

含量測定成分的選擇主要考慮所含的活性成分、君（臣）藥的特征成分、處方中大多數藥味的提取工藝等情況。消糖靈片中知母、天花粉、黃連為君藥；人參、黃芪為臣藥；枸杞子、白芍、丹參、五味子為佐藥；杜仲、沙苑子為使藥。其中君藥天花粉的主要有效成分為蛋白質類、多糖類等，均無紫外吸收。其生產工藝中君藥黃連、人參采取粉碎為細粉入藥，其余藥材采用水提醇沉法提取。人參的主要有效成分有人參皂苷類，為脂溶性成分，且最大吸收波長在203 nm，在擬定條件下難以檢出。因此選擇知母、黃連、黃芪、白芍和五味子的活性成分進行含量測定。鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿歸屬于黃連藥材，芒果苷歸屬于知母藥材，芍藥苷歸屬于白芍藥材，毛蕊異黃酮葡萄糖苷歸屬于黃芪藥材，五味子醇甲歸屬于五味子藥材[10-15]，各組分涵蓋君、臣、佐多味藥材的有效成分。結果顯示，15批消糖靈片中鹽酸小檗堿、鹽酸黃連堿、芒果苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、五味子醇甲、格列本脲7 種成分含量的RSD分別為 2.5%、7.3%、17.2%、7.4%、12.3%、13.1%、3.7%，表明不同批次的消糖靈片質量存在一定差異，這可能是投料藥材質量存在差異所導致的。

3.4 CA與PCA

因目前僅有一個廠家生產消糖靈片，故筆者通過從生產和流通環節總共收集了不同批次的15個樣本。按照樣品中各成分的含量，在CA與PCA中將15個樣本分為兩大類。同時OPLS-DA 分析出對分組貢獻較大的差異標志物10個，建議生產廠家對這10個標志物進行重點關注，跟蹤這些標志物在各生產環節中的變化。本研究建立的指紋圖譜、多組分含量測定，結合化學模式識別方法為不同批次的消糖靈片質量一致性提供新思路，能有效彌補現有標準的不足，可供企業在原藥材來源、運輸儲存、生產工藝等各個環節進行監控，以便科學、系統地保證藥品的質量。

綜上所述，所建立的UPLC指紋圖譜穩定、可行，含量測定方法簡便、準確、重復性好，結合化學模式識別分析可為消糖靈片的質量控制和質量評價提供參考。